Estudios sobre el efecto antiinflamatorio de las píldoras Xiaoyao en el tratamiento de la osteoporosis posmenopáusica en ratones

Resumen

La osteoporosis posmenopáusica se ha convertido en un problema de salud pública mundial. El objetivo de este estudio es explorar los efectos terapéuticos y los mecanismos relacionados de las píldoras de medicina tradicional china Xiaoyao sobre esta afección.

Resumen

La osteoporosis es una enfermedad metabólica común de las mujeres ancianas y posmenopáusicas, sin síntomas evidentes durante sus primeras etapas. En las últimas etapas de esta afección, los pacientes son propensos a sufrir fracturas, lo que puede afectar seriamente su salud y calidad de vida. El aumento de la esperanza de vida en todo el mundo ha convertido a la osteoporosis en una preocupación mundial. Las píldoras Xiaoyao fueron anteriormente
Se utiliza en el tratamiento de la depresión. Además, el fármaco parecía tener una actividad similar a la del estrógeno, lo que afectó a la expresión de ALP, un marcador temprano específico del osteoblasto, y COL-1, un componente importante de la matriz extracelular ósea. Las píldoras de Xiaoyao se evaluaron por sus efectos sobre la osteoporosis posmenopáusica (PMOM) en ratones. Se accedió a la información objetivo de cada componente herbal de las píldoras Xiaoyao a través de la base de datos de Farmacología de los Sistemas de Medicina Tradicional China (TCMSP). La información de GeneCards, OMIM, PharmGkb, TTD, DrugBank y otros sitios web se utilizó para construir la red reguladora del complejo herbal a través de Cytoscape y la red String para evaluar las interacciones de las proteínas. Los ratones fueron ovariectomizados y tratados con dosis altas y bajas de píldoras Xiaoyao y estos se compararon con los controles. Sus síntomas se evaluaron mediante inmunocitoquímica de los tejidos óseos. Los resultados sugirieron que las píldoras de Xiaoyao tenían la capacidad de aliviar los síntomas de PMOM en ratones ovariectomizados a través de la vía de señalización IL-17. Este fármaco tiene el potencial de convertirse en un nuevo agente terapéutico para el tratamiento de la osteoporosis.

Introducción

La Organización Mundial de la Salud (OMS) define la osteoporosis (OP) como una enfermedad caracterizada por una disminución de la masa ósea y un deterioro de la microarquitectura del tejido óseo, lo que conduce a un aumento de la fragilidad ósea y, por lo tanto, a un mayor riesgo de fractura¹. La importancia clínica de la osteoporosis es que puede conducir a fracturas, las cuales se asocian con alta mortalidad, morbilidad y costos económicos². La osteoporosis posmenopáusica (PMOP) es causada por una disminución de los niveles de estrógeno en las mujeres después de la menopausia, lo que conduce a un aumento de la actividad de los osteoclastos, lo que resulta en pérdida ósea y destrucción de la microestructura ósea. Esto a menudo causa osteoporosis con un grave impacto en la salud³. Las terapias actuales para la PMOP incluyen terapia de reemplazo de estrógenos, bifosfonatos y hormona paratiroidea, pero pueden tener diversos grados de efectos adversos, un cumplimiento insuficiente a largo plazo y altos costos⁴. Por lo tanto, la medicina herbal asequible es una alternativa viable para una gran proporción de la población.

Las píldoras Xiaoyao están incluidas en la Farmacopea^{China 5} y contienen ocho componentes herbales, que incluyen Chai Hu, Angelica sinensis, Paeonia lactiflora blanca, Atractylodes macrocephala, Poria cocos, Menthae Herba, regaliz y jengibre fresco. Se sabe que todas estas hierbas son efectivas para desintoxicar el hígado y fortalecer el bazo, nutrir la sangre y regular el ciclo menstrual, y la mezcla también se ha utilizado para tratar^{la depresión.} Sin embargo, el papel de las píldoras Xiaoyao en la osteoporosis no está claro.

Los primeros estudios han sugerido que la inflamación puede conducir a la pérdida ósea⁷, y que la disminución de la densidad ósea asociada con este proceso puede acelerarse con la menopausia. Además, existe una fuerte relación entre el desarrollo de osteoporosis y la inflamación. El factor inflamatorio, interleucina-17 (IL-17), es un factor proinflamatorio secretado por las células Th17, un subconjunto de linfocitos T CD4+. Estas células se asocian con varias afecciones inflamatorias crónicas y desempeñan un papel importante en el desarrollo de la destrucción ósea en la artritis reumatoide⁸. Además, la IL-17 estimula el activador del receptor del ligando del factor nuclear κ B (RANKL), que regula la osteoclastogénesis, lo que conduce a una mayor resorción ósea que la formación ósea⁹. La IL-17 estimula la expresión de otras citocinas osteoclastogénicas como TNFα, IL-1, IL-6 e IL-8. Tiene la capacidad de sinergizar con otros factores inflamatorios, lo que lo convierte en un importante efector inflamatorio¹⁰.

Los estudios también han demostrado un vínculo entre las píldoras Xiaoyao y la inflamación. Shi et ^al.11 y Fang et ^al.12 han confirmado recientemente que las píldoras de Xiaoyao pueden reducir los niveles de IL-6 y TNF-α, respectivamente. En otro estudio sobre la esteatohepatitis asociada al metabolismo, se informó que las píldoras de Xiaoyao podrían regular al alza la expresión de ácido propiónico, que a su vez inhibe la expresión de TNF-α y ejerce un efecto antiinflamatorio¹³. Sin embargo, en la actualidad, no se sabe si las píldoras de Xiaoyao pueden regular el desarrollo de PMOM mediando una respuesta inflamatoria a través de la IL-17, que fue el objetivo de este estudio.

Este estudio predijo la intersección de los objetivos de las píldoras Xiaoyao y los genes relacionados con la osteoporosis a través de la farmacología de redes y el análisis bioinformático y analizó los genes que se cruzan para las interacciones de proteínas, GO y KEGG. Con base en los resultados previstos, se puede observar la expresión de Act1 e IL-6, que son proteínas clave en la vía de señalización de IL-17,^14,15, así como los marcadores de recambio óseo fosfatasa alcalina (ALP) y colágeno tipo I (COL-1), para observar la eficacia terapéutica de las píldoras de Xiaoyao en el modelo de ratones PMOM.

Protocolo

El Comité de Ética de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica de Youjiang para las Nacionalidades aprobó el protocolo del estudio (número de aprobación: 2022101502). Los ratones hembra C57BL/6, de 10 a 12 semanas de edad, clase SPF y pesos corporales (22 ± 2) g, se alojaron en el Centro de Experimentación Animal de Clase SPF de la Universidad Médica de Youjiang para las Nacionalidades. Los animales de experimentación se mantuvieron a una temperatura de 24-26 °C y una humedad relativa de 55% a 60%.

1. Base de datos y plataforma de análisis de farmacología de los sistemas de medicina tradicional china

NOTA: La Base de Datos y Análisis de Farmacología de los Sistemas de Medicina Tradicional China (TCMSP; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) son plataformas de farmacología de la medicina china que contienen información sobre los ingredientes de la medicina tradicional china, las propiedades relacionadas con el ADME, los objetivos y las enfermedades^16,17.

1. Acceda a la interfaz web de TCMSP. Busque el nombre de Herb, ingrese el nombre de la medicina china y haga clic en Buscar. Haga clic en Nombre latino en los resultados de búsqueda. Realizar un cribado de los resultados de los ingredientes con los parámetros OB ≥ 30% y DL ≥ 0,18.
2. Copie todos los resultados y guárdelos en formato TXT, llamado Medicina China Name_ingredients.txt.
3. En Información de destinos, en la pestaña Destinos relacionados, filtre por Mol ID (es decir, el resultado del paso 1.2).
4. Copie los resultados filtrados y guárdelos en formato TXT llamado Medicina China Name_targets.txt.
   NOTA: A través de los pasos anteriores, se obtuvieron todos los ingredientes activos elegibles y la información objetivo correspondiente de la medicina tradicional china (MTC).
5. Coloque todos los archivos ingredients.txt y targets.txt anteriores en la misma carpeta y coloque los scripts Perl (Archivo de codificación suplementario 1) en esa carpeta.
6. Abra CMD, escriba la ruta de la carpeta cd, ingrésela y ejecute el script Perl. Obtener un nuevo archivo de texto (allTargets.txt). Este nuevo archivo de texto (allTargets.txt) contiene el nombre de la hierba, el nombre del ingrediente, el ID del ingrediente y el objetivo.

2. Base de datos UniProt

NOTA: La base de datos UniProt (https://www.uniprot.org/) contiene secuencias de proteínas humanas anotadas con información funcional, y se utiliza para normalizar los nombres de los objetivos a sus nombres oficiales¹⁸.

1. Vaya a la interfaz web de UniProt. Haga clic en la pestaña Buscar , seleccione UniProtKB y haga clic en Buscar.
2. Filtre en la barra lateral izquierda, seleccione Revisado (Swiss-Prot) para Estado y Humano para Organismos populares. Haga clic en Descargar, seleccione Descargar todo, seleccione TSV para Formato y haga clic en Descargar para descargar el archivo de anotación.
3. Descomprima el archivo descargado en la carpeta actual, abra el archivo descomprimido y cópielo y péguelo en un archivo de texto llamado ann.txt.

3. Conversión de ID de diana de fármaco

1. Coloque todos los archivos de diana de drogas allTargets.txt obtenidos en la sección 1 y el archivo de anotación UniProt ann.txt obtuvo en la sección 2 en una carpeta y coloque los scripts de Perl (Supplementary Coding File 2) en ella.
2. Abra CMD, escriba cd + espacio + ruta de la carpeta, ingréselo y ejecute el script Perl para obtener un nuevo archivo de texto (allTargets.symbol.txt). Este nuevo archivo de texto (allTargets.symbol.txt) contiene el nombre de la hierba, la identificación del ingrediente, el nombre del ingrediente y la identificación del gen.

4. Búsqueda en la base de datos

1. GeneCards: Base de datos de genes humanos (GeneCards)
   NOTA: La base de datos GeneCards (https://www.genecards.org/) proporciona información de predicción y anotación para genes humanos. Se utiliza para acceder a los objetivos de la enfermedad^19,20.
   1. Vaya a la interfaz web de GeneCards. Escriba osteoporosis en el cuadro de búsqueda y haga clic en Buscar.
   2. Haga clic en Exportar y seleccione Exportar a Excel.
   3. Abra el archivo descargado, copie los genes con una puntuación de relevancia ≥ 1, péguelos y guárdelos en un archivo llamado GeneCards.txt.
2. Base de datos OMIM
   NOTA: La base de datos OMIM (https://omim.org) contiene genes humanos, enfermedades genéticas y rasgos²¹.
   1. Vaya a la interfaz web de OMIM. Haga clic en GENE Map, escriba osteoporosis en el cuadro de búsqueda y haga clic en Buscar.
   2. Haga clic en Descargar como y seleccione Archivo de Excel.
   3. Abra el archivo descargado, copie el nombre del gen en la columna Símbolo aprobado, péguelo y guárdelo en un archivo llamado OMIM.txt.
3. Base de datos PharmGkb
   NOTA: PharmGkb (https://www.pharmgkb.org), la base de conocimientos de farmacogenómica, contiene anotaciones en las etiquetas de los medicamentos, vías centradas en los medicamentos, resúmenes farmacogenéticos y relaciones entre genes, medicamentos y enfermedades²².
   1. Vaya a la interfaz del sitio web de PharmGkb. Ingrese osteoporosis en el cuadro de búsqueda, haga clic en Buscar y marque Gen en la barra lateral izquierda.
   2. Ingrese todos los resultados manualmente y guárdelos en un archivo llamado PharmGkb.txt.
4. TTD: Base de datos de dianas terapéuticas (TTD)
   NOTA: La base de datos TTD (https://idrblab.org/ttd/) proporciona información sobre las dianas de proteínas y ácidos nucleicos, las enfermedades objetivo, la información sobre las vías y los fármacos correspondientes para cada diana²³.
   1. Vaya a la interfaz web de TTD. Escriba osteoporosis en el cuadro de búsqueda y haga clic en Buscar.
   2. Haga clic en Información de destino en ID de destino en el resultado, copie el nombre de destino, péguelo y guárdelo en un archivo llamado TTD.txt. Se obtuvieron un total de 33 resultados. Guarde cada resultado de la misma manera.
5. Base de datos en línea de DrugBank (DrugBank)
   NOTA: La base de datos de DrugBank (https://go.drugbank.com) contiene información sobre fármacos y dianas farmacológicas, interacciones farmacológicas, mecanismos farmacológicos y metabolismo farmacológico²⁴.
   1. Vaya a la interfaz del sitio web de DrugBank. Seleccione Indicaciones en la pestaña de búsqueda, escriba osteoporosis en el cuadro de búsqueda y haga clic en Buscar.
   2. Haga clic en la entrada Osteoporosis en los resultados para obtener más información, haga clic en la pestaña FÁRMACOS Y DIANAS y haga clic en el enlace apropiado en la columna TARGET de la tabla.
   3. Haga clic en Detalles en Proteína, copie el nombre del gen, péguelo y guárdelo en un archivo llamado DrugBank.txt. Guarde cada resultado de la misma manera.

5. Diagrama de Venn

1. Fusión de genes asociados a enfermedades y mapeo de Venn
   1. Coloque los archivos txt guardados, así como el script, en la misma carpeta.
   2. Abra el código R (Merge Disease-Related Genes), copie y pegue la ruta donde se almacena el archivo txt anterior en la línea donde se encuentra el setwd en el código R.
   3. Abra el software R, ejecute el código R modificado y guarde. Establezca el gen, asigne un nombre al archivo Disease.txt.
   4. Abre el sitio web de Draw Venn Diagram; en la sección de entrada, copie y pegue el contenido de texto guardado en las secciones 4 a 8 uno por uno en la lista, asígnele un nombre con la base de datos respectiva y haga clic en Enviar.
   5. Haga clic en Guardar imagen como PNG debajo de la imagen y guarde el resultado del texto en la misma carpeta.
2. Intersección de dianas farmacológicas y genes asociados a enfermedades
   1. Coloque el archivo allTargets.symbol.txt obtenido en la sección 3 y el archivo Disease.txt obtenido en el paso 5.1.3 en la misma carpeta.
   2. Abra el código R (el objetivo del fármaco y el gen relacionado con la enfermedad se interseccionan), copie y pegue la ruta donde se almacena el archivo txt anterior en la línea donde se encuentra el setwd en el código R.
   3. Abra el software R, ejecute el código R modificado y guarde. Establezca el gen, nombre del archivo Drug_Disease.txt.
   4. Abre el sitio web de Draw Venn Diagram. En la sección de entrada, copie y pegue allTargets.symbol.txt y Disease.txt en la lista y asígneles el nombre de sus archivos respectivos.
   5. Haga clic en Guardar imagen como PNG debajo de la imagen y guarde los resultados del texto en la misma carpeta.

6. Construcción de la red reguladora de la composición TCM

1. Coloque el archivo allTargets.symbol.txt obtenido en la sección 3 en la misma carpeta que el archivo Disease.txt y el script Perl correspondiente (Archivo de codificación suplementario 3).
2. Abra CMD, escriba la ruta del archivo cd, presione Enter y ejecute el script Perl. Obtén cuatro nuevos archivos txt: net.geneLists.txt, net.molLists.txt, net.network.txt y net.type.txt. El archivo network.txt contiene el ID del ingrediente de la MTC, el gen objetivo, la relación entre el objetivo y el nombre del ingrediente. net.type.txt contiene el nombre del nodo, los atributos y la afiliación. net.geneLists.txt es la lista de genes, y net.molLists.txt es la lista de ingredientes.
3. Copie los archivos de texto recién obtenidos en la misma carpeta nueva.
4. Abra el software Cytoscape 3.9.1, haga clic en Archivo, haga clic en Importar y seleccione Archivo de formulario de red. Seleccione net.network.txt, coloque la primera columna de Component ID como Nodo de origen, la segunda columna de Genes como Nodo de destino y la tercera columna de Relación de segmentación como Tipo de interacción y haga clic en Aceptar.
5. Importe net.type.txt desde la ventana Tabla de nodos. Haga clic en la pestaña Seleccionar, seleccione Nodos, seleccione Del archivo de lista de ID, seleccione net.geneLists.txt y haga clic en Abrir.
6. Haga clic en la pestaña Diseño, seleccione Diseño de círculo ordenado por grados y seleccione Solo nodos seleccionados. Ajuste la altura y la anchura de los nodos a 70.
7. Haga clic en el segundo cuadro de Altura, seleccione degree.layout en Columna, seleccione Mapeo continuo en Tipo de mapeo y haga doble clic en la Ventana de ajuste de altura en el lado derecho de Mapeo actual para ajustar los límites superior e inferior de la altura a un rango adecuado.
8. Repita la operación con la opción Anchura.
9. Vuelva a hacer clic en la pestaña Diseño y haga clic en Herramientas de diseño > Ajustar la escala para que los nodos no se superpongan.
10. Haga clic en la ventana superior derecha del software para desmarcar la red de nodos, haga clic en la pestaña Seleccionar , seleccione Nodos, seleccione Del archivo de lista de ID, seleccione net.molLists.txt y haga clic en Abrir.
11. Haga clic en la pestaña Diseño, seleccione Diseño de atributos de grupo, seleccione Solo nodos seleccionados y haga clic en Tipo.
12. Haga clic en Tamaño de fuente de etiqueta en la columna de la izquierda y establezca Valor predeterminado en 12. Haga clic en Valor predeterminado en Imagen/Gráfico 1 en la columna de la izquierda.
13. Seleccione Gráficos en la ventana emergente, haga clic en Gráfico circular y seleccione los elementos de la columna Columnas disponibles, excepto el grado. Diseño en la columna de columnas seleccionadas y haga clic en Aplicar.
14. Haga clic en Pintura de borde en la columna de la izquierda y establezca el Valor predeterminado en #003EF8. Haga clic en la pestaña Borde en la parte inferior de la barra lateral izquierda y establezca Ancho en 0.8.
15. Haga clic en Archivo en la barra de herramientas superior, seleccione Exportar y, a continuación, seleccione Red a imagen.
16. En la ventana emergente, seleccione Formato PNG para Formato, seleccione el directorio de guardado y asigne un nombre a la red de imágenes, ajuste el tamaño de la imagen al máximo del 500%, seleccione Fondo transparente y haga clic en Aceptar para terminar de guardar la imagen.

7. Construcciones de redes de interacción proteína-proteína (PPI)

1. Abra el sitio web de STRING (https://string-db.org/), haga clic en Proteína múltiple, haga clic en Examinar en Cargar un archivo, seleccione el archivo Drug_Disease.txt obtenido en el paso 5.2.3 y seleccione Homo sapiens en organismos. Haga clic en Buscar y haga clic en Continuar.
2. Haga clic en Configuración, establezca la puntuación de interacción mínima requerida en la confianza más alta (0,900) y marque Ocultar nodos desconectados en la red en las opciones de visualización de la red. Haga clic en Actualizar.
3. Realice ajustes en los nodos del diagrama de red para que no haya superposición ni oclusión.
4. Haga clic en Exportaciones y haga clic en Descargar como mapa de bits de alta resolución para obtener el mapa de la red de interfuncionamiento de proteínas en formato PNG. Además, descargue el archivo TSV como una salida de texto tabular corta. Guarde ambos archivos en una carpeta unificada. El archivo TSV contiene el nombre del gen, el ID interno de STRING y las puntuaciones de los diferentes atributos.

8. Construcción del núcleo de la red PPI

1. Coloque el archivo TSV obtenido en la sección 7 y los scripts Perl necesarios en una nueva carpeta.
2. Abra el software Cytoscape 3.9.1, haga clic en Archivo, seleccione Importar, haga clic en Red desde archivo, seleccione el archivo TSV anterior, coloque el nodo de la primera columna 1 como Nodo de origen y el segundo nodo de columna 2 como Nodo de destino, y haga clic en Aceptar.
3. Haga clic en Estilo en la barra lateral izquierda, haga clic en Valor predeterminado en Ancho y establézcalo en 60. Arrastre y suelte los nodos para que no haya superposición ni oclusión en la red.
4. Haga clic en APLICACIONES en la barra de herramientas superior, haga clic en CytoNCA y haga clic en Abrir.
5. En la columna de la izquierda, seleccione Sin peso en Intersección, Cercanía, Grado, Vector propio, Método basado en conectividad de promedio local y Red, y haga clic en Analizar.
6. Cuando se complete el análisis, haga clic en Tabla de nodos en la ventana inferior derecha, haga clic en Exportar, guárdelo en la carpeta y asígnele el nombre puntuación 1.
   NOTA: El complemento CytoNCA debe instalarse en el software Cytoscape. Para ello, haga clic en Aplicaciones en la barra de herramientas superior, haga clic en Administrador de aplicaciones, escriba CytoNCA en el cuadro de búsqueda, marque CytoNCA en la columna central de los resultados devueltos y haga clic en Instalar.
7. Abra score1, ajuste la columna de nombre a la primera columna, copie la información de la tabla, péguela en un nuevo archivo de texto, asígnele score1.txt nombre y guárdela.
8. Abra el código R y copie y pegue la ruta donde se encuentra el archivo score1.txt en la línea donde se encuentra el setwd en el código R.
9. Abra el software R y ejecute el código modificado para obtener dos archivos nuevos, score2.txt y score2.gene.txt. El archivo score2.txt contiene los genes para los cuales todas las puntuaciones del programa fueron mayores que la mediana y las puntuaciones específicas de cada programa. score2.gene.txt contiene los genes que obtuvieron una puntuación superior a la mediana de todos los ítems.
10. Para continuar en Cytoscape, haga clic en AnalysisPanel 1 en la ventana inferior derecha, haga clic en Cargar desde archivo en el lado izquierdo de la ventana, seleccione la score2.gene.txt, haga clic en Abrir y toque Aceptar en la ventana emergente.
11. Haga clic en Seleccionar nodos en la parte inferior y haga clic en Aceptar en la ventana emergente.
12. Haga clic en Archivo en la barra de herramientas superior, seleccione Exportar, haga clic en Red a imagen, ajuste el Zoom (%) en el tamaño de la imagen al máximo 500%, marque Fondo transparente y guarde el archivo en la misma carpeta, asígnele el nombre network1.
13. Haga clic en Crear subred en la barra lateral derecha de la ventana inferior para crear una subred, analizar la subred, haga clic en APP en la barra de herramientas de la parte superior, haga clic en CytoNCA y haga clic en Abrir.
14. En la barra lateral izquierda, seleccione Sin peso en Interrupción, Cercanía, Grado, Vector propio, Método basado en conectividad de promedio local y Red, y haga clic en Analizar.
15. Cuando finalice el análisis, haga clic en Tabla de nodos en la ventana inferior derecha, haga clic en Exportar y guárdelo en una nueva carpeta llamada score2.
16. Abra score2, ajuste la columna de nombre a la primera columna, copie la información de la tabla, péguela en un nuevo archivo de texto, asígnele score2.txt nombre y guárdela.
17. Abra el código R y copie y pegue la ruta donde se encuentra el archivo score2.txt en la línea donde se encuentra el setwd en el código R.
18. Abra el software R y ejecute el código modificado para obtener dos archivos nuevos: score3.txt y score3.gene.txt. El archivo score3.txt contiene los genes que obtuvieron una puntuación superior a la mediana para todos los ítems y las puntuaciones específicas para cada ítem. score3.gene.txt contiene los genes que obtuvieron una puntuación superior a la mediana de todos los ítems.
19. Para continuar en Cytoscape, haga clic en AnalysisPanel 1 en la ventana inferior derecha, haga clic en Cargar desde archivo en el lado izquierdo de la ventana, seleccione el score3.gene.txt, haga clic en Abrir y toque Aceptar en la ventana emergente.
20. Haga clic en Seleccionar nodos en la parte inferior y haga clic en Aceptar en la ventana emergente.
21. Haga clic en Archivo en la barra de herramientas superior, seleccione Exportar, haga clic en Red a imagen, ajuste el Zoom (%) en el tamaño de la imagen al 500%, marque Fondo transparente y guarde el archivo en la misma carpeta que la utilizada en este paso, nombrándolo network2.
22. Haga clic en Crear subred en la barra lateral derecha de la ventana de abajo para crear una subred.
23. Haga clic en Archivo en la barra de herramientas en la parte superior, seleccione Exportar, haga clic en Red a imagen, ajuste el Zoom (%) en el tamaño de la imagen al máximo de 500%, marque Fondo transparente y guarde el archivo en la misma carpeta que se usó en este paso y asígnele el nombre network3.

9. Conversión de ID de genes

1. Coloque el archivo Drug_Disease.txt en la misma carpeta nueva que el archivo de código requerido.
2. Abra el código R (Archivo de codificación suplementario 4) y copie y pegue la ruta donde se encuentra el archivo Drug_Disease.txt a la línea donde se encuentra el setwd en el código R.
3. Abra el software R, ejecute el código modificado usando la org. Hs.eg.db paquete para convertir el ID del gen y ejecutarlo después de completar un nuevo archivo id.txt. El id.txt contiene el símbolo del gen y el ID correspondiente.

10. Análisis de enriquecimiento de GO

1. Coloque el archivo id.txt del paso anterior en la misma carpeta que el código de análisis de enriquecimiento de GO.
2. Abra el código R (Supplementary Coding File 5) y establezca el directorio de trabajo en id.txt y la ruta donde se almacena el código GO.
3. Abra el software R, ejecute el código modificado y use clusterProfiler, org. Hs.eg.db, enriquezca el gráfico, el gráfico ggplot2, los histogramas de análisis de enriquecimiento GO y los diagramas de burbujas. Obtenga tres archivos nuevos, GO.txt, barplot.pdf y bubble.pdf, una vez completada la ejecución.
   NOTA: El GO.txt es el archivo de resultados de enriquecimiento que contiene la clasificación de enriquecimiento (BP, CC, MF), GO ID, nombre GO, proporción de genes, proporción de fondo, valor p de importancia del enriquecimiento, valor p corregido (p.ajuste, valor), ID de gen (nombre) y número de genes enriquecidos en cada GO. barplot.pdf es el histograma, burbuja. PDF es un diagrama de burbujas.

11. Análisis de enriquecimiento de KEGG

1. Coloque el archivo id.txt en la misma carpeta que el código de análisis de enriquecimiento KEGG.
2. Abra el código R (Supplementary Coding File 6) y establezca el directorio de trabajo en la ruta donde se almacenan id.txt y el código KEGG.
3. Abra el software R, ejecute el código modificado y use clusterProfiler, org. Hs.eg.db, enrichplot, paquete ggplot2 para trazar histogramas de análisis de enriquecimiento GO, diagramas de burbujas y gráficos de ruta. La tirada se completa con la producción de tres nuevos archivos, KEGG.txt, barplot.pdf y bubble.pdf.
   NOTA: El archivo KEGG.txt es un archivo de resultados de enriquecimiento que contiene el ID de la vía, la descripción de la vía, la proporción de genes, la proporción de fondo, el valor p de la importancia del enriquecimiento, el valor p corregido (p.adjust, qvalue), el ID del gen (nombre) y el número de genes enriquecidos en cada vía. barplot.pdf es un gráfico de barras y bubble.pdf es un gráfico de burbujas.
4. Busque IL-17 en el archivo KEGG.txt; El resultado muestra que solo hay un camino; copie el ID de la ruta.
5. Abra el código R, pegue el ID de la ruta IL-17 en KEGGID y use el paquete pathview para etiquetar el mapa de ruta. Ejecute el código R modificado y obtenga dos archivos nuevos, hsa04657.pathview.png y hsa04657.png.
   NOTA: El archivo hsa04657.png es el mapa de rutas, hsa04657.pathview.png es el mapa de rutas etiquetado, y los marcados en rojo son los genes presentes en la red de interacciones.

12. Preparación de las píldoras Xiaoyao

NOTA: Para conocer el método de preparación utilizado, consulte la Farmacopea China⁵.

1. Tomar 100 g de Chai Hu, 100 g de Angelica sinensis, 100 g de Paeonia lactiflora blanca, 100 g de Atractylodes macrocephala salteados, 100 g de Poria cocos, 80 g de Radix glycyrrhizae preparate y 20 g de Menthae herba.
2. Usando un molino de piedra o una máquina pulverizadora, triture las hierbas hasta obtener un polvo fino; Varias hierbas se combinan en las proporciones anteriores y se pulverizan hasta obtener un polvo fino para mezclarse de forma natural. Utilice un tamiz de fármaco de 80 mallas con un diámetro interior de 180 μm ± 7,6 μm y tamice el polvo pulverizado. Homogeneizar.
3. Tome 100 g de jengibre, agregue agua y hiérvalo 2 veces durante 20 minutos cada vez. Colar y reservar.
4. Tome una placa medicinal, sumerja una escoba pequeña en agua de jengibre, úntela sobre la placa, tome el polvo anterior, espolvoréelo sobre el agua de jengibre y gire la placa para que todo el polvo esté húmedo y se pueda moldear en forma de bola.
   NOTA: La formación de la placa medicinal es un paso esencial durante la preparación de las píldoras de MTC. La mayor parte del bambú moso se dividirá en tiras y se tejerá en un esqueleto. La piel de bambú, o tengpi, se teje en la superficie y se redondea. La superficie de la placa debe recubrirse finamente con aceite de tung y luego cepillarse con una capa de barniz. Este se seca para que se vuelva hermético. Las píldoras hechas de esta manera serán redondas y suaves.
5. Vuelva a cepillar el agua de jengibre, espolvoree el polvo y gire la placa para que el medicamento se redondee y agrande gradualmente. Coloque en un lugar fresco para que se seque.

13. Establecimiento del modelo animal

1. Después de 7 días de aclimatación, divida aleatoriamente los ratones experimentales en 4 grupos, a saber, el grupo de operación simulada (Sham, donde solo se eliminó la grasa alrededor de los ovarios) y tres grupos de ratones ovariectomizados que consisten en un grupo modelo (OVX), así como grupos de administración de píldoras Xiaoyao de baja y alta concentración.
2. Anestesiar a los ratones con pentobarbital sódico al 3% (40 mg/kg) inyectado por vía intraperitoneal. Compruebe que los ratones entran en el estado de anestesia observando la relajación muscular generalizada, la respiración profunda y lenta y la lentitud de los movimientos. Aplique ungüento ocular en los ojos de los ratones antes de la cirugía.
3. Coloque a los animales en posición prona y afeita la región renal de la espalda con una afeitadora de animales. Realizar la desinfección local con etanol al 75%.
4. Realice una incisión longitudinal de aproximadamente 1 cm bilateralmente, cerca de la región dorsal del riñón, e incida en la fascia para separar los músculos y el peritoneo.
5. Localice la parte superior del cuerno uterino y las trompas de Falopio para la ligadura. Inserte pinzas en la incisión para la exploración y localice el ovario, cubierto por tejido adiposo en un patrón de coliflor rojo brillante, con trompas de Falopio dispuestas en espiral debajo del ovario, conectando el ovario con el cuerno uterino²⁵. Extirpar los ovarios con tijeras quirúrgicas y sutura.
6. Extraer una pequeña cantidad de tejido adiposo cerca del ovario como control en el grupo de operación simulada. Observa a los animales hasta que recuperen la conciencia. Coloque a los animales postoperatorios en jaulas separadas hasta su recuperación completa.
7. Para prevenir la infección, administre gentamicina a los ratones durante 3 días después de la operación. Después de la operación, asegúrese de tener una dieta normal y un buen entorno de crecimiento de acuerdo con la condición real de los ratones. Si hay alguna anomalía, como infección de la herida o pérdida de apetito, consulte inmediatamente al instructor del Centro de Animales de Laboratorio.

14. Administración de medicamentos

NOTA: De acuerdo con la Metodología Experimental de Farmacología²⁶, la conversión de las dosis humanas y animales utilizadas fue de 9 g de pastillas de Xiaoyao para un adulto de 70 kg, lo que equivale a una dosis (dosis para una sola administración).

1. Para los grupos de dosis baja y alta, utilizar 0,683 g/kg y 2,73 g/kg, respectivamente, para un grupo de 8 animales. Use la mano izquierda para inmovilizar el ratón de modo que la boca del ratón quede en línea recta con el esófago. Sosteniendo la aguja de sonda nasogástrica en la mano derecha, insértela suavemente en el esófago a lo largo de la pared posterior de la faringe desde la comisura de la boca del ratón.
2. En este punto, la dirección de la aguja de sonda nasogástrica puede alterarse ligeramente para estimular una acción de deglución inducida. Inyectarse la droga. Realice esto una vez al día durante 12 semanas.
3. Para los grupos operados simuladamente y modelo, administre solución salina una vez al día durante 12 semanas en una cantidad determinada por el peso del animal.
4. Sacrificar ratones por dislocación cervical y cortarles las extremidades traseras. Despellejar las extremidades para separar el músculo del fémur. Trate los fémures de los ratones con una solución de descalcificación de EDTA durante 1 mes y reemplácelos con una solución fresca todos los días.

15. Tinción de hematoxilina-eosina (HE)

1. Desparafinar los tejidos femorales durante 8 min y luego colocarlos en etanol de gradiente durante 3 min; Enjuague con agua corriente durante 1 min.
2. Agregue la solución de tinción de hematoxilina gota a gota a las secciones para cubrir completamente el tejido, tiña durante 5 minutos y lave con agua del grifo
3. Agregue la solución de diferenciación de ácido clorhídrico al tejido en el portaobjetos, asegurándose de que cubra completamente el tejido. Deténgase cuando se observe decoloración del tejido. Enjuague con agua del grifo.
4. Agregue la solución de colorante de eosina gota a gota y deje cubrir el tejido por completo, actuando durante 30 s a 2 min. Enjuaga el exceso de tinte con agua corriente.
5. Realice la deshidratación de etanol en gradiente con etanol anhidro al 75% durante 5 minutos, seguido de etanol anhidro durante 5 minutos y limpie con solución desparafinadora durante 3 minutos.
6. Deje caer una cantidad adecuada de goma neutra en el portaobjetos de acuerdo con el tamaño del pañuelo, y baje el cubreobjetos con cuidado, evitando las burbujas de aire.

16. Micro-CT e inmunohistoquímica

1. Eliminar el exceso de músculos y ligamentos alrededor del fémur de diferentes grupos de ratones y fijar los tejidos de la muestra en paraformaldehído al 4% durante 24 h.
2. Seque los tejidos óseos al aire y realice micro-CT mediante escaneo de tejido óseo para obtener datos tridimensionales de micro-CT.
3. De los bloques de cera de ratón conservados, córtelos en secciones continuas de 6 μm de grosor y hornee las rodajas a 70 °C -72 °C durante 30-60 min.
4. Desparafinar durante 8 minutos, seguido de un tratamiento con etanol anhidro al 75% durante 5 minutos, etanol anhidro durante 5 minutos y enjuague con PBS durante 5 minutos durante 3 veces.
5. Realice la reparación de alta presión con EDTA durante 15 minutos, seguida de un lavado con PBS durante 5 minutos durante 3 veces.
6. Agregue peróxido de hidrógeno al 3% gota a gota al pañuelo, incube a temperatura ambiente durante 10 minutos y lave con PBS durante 5 minutos durante 3 veces.
7. Use un bolígrafo de inmunohistoquímica para dibujar un círculo. Lavar con PBS lavar durante 3 min para 3x.
8. Tinción en el anticuerpo primario (pAb de conejo anti-ALP (1:200), pAb de conejo anti-COL-1 (1:200), pAb de conejo anti-IL-17 (1:275), anti-Act1 (1:500), pAb de conejo anti-IL-6 (1:500)) durante la noche, seguido de enjuague con tampón PBS durante 5 min durante 3 veces.
9. Añadir gota a gota el anticuerpo secundario (Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L; 1:2000) conjugado con HRP) e incubar a temperatura ambiente durante 60 min. Lavar con tampón PBS durante 3 min para 3x.
10. Incubar en DAB listo para usar durante 3-5 min, luego enjuagar con PBS.
11. Vuelva a tingir con hematoxilina durante 3 minutos, seguido de un enjuague con PBS.
12. Utilice la solución de diferenciación durante unos 10 s, seguida de un enjuague con PBS.
13. Agregue la solución azul de retorno durante 10 s, seguido de enjuague con PBS.
14. Realice un tratamiento con etanol anhidro al 75% durante 5 minutos, etanol anhidro durante 5 minutos y transparente durante 3 minutos. Utilice resina neutra para sellar los portaobjetos.

Resultados

Ingredientes activos y objetivos de acción de las píldoras Xiaoyao
Al buscar en la base de datos de TCMSP y realizar el cribado según los criterios de biodisponibilidad oral (OB) ≥ 30% y propiedades similares a los medicamentos (DL) ≥ 0,18, se encontró que existían 125 ingredientes activos en las píldoras de Xiaoyao. Entre ellos, los ingredientes 6, 4, 9, 13, 2, 6, 83 y 2 eran de Paeonia lactiflora blanca, Atractylodes macrocephala, Menthae herba, Chaihu, Angel...

Discusión

Según las estadísticas, la osteoporosis causa 1,5 millones de fracturas cada año en los Estados Unidos, y la gran mayoría de ellas ocurren en mujeres posmenopáusicas²⁷. Con el aumento del envejecimiento de la población, se prevé que la mayoría de las futuras fracturas de cadera del mundo se producirán en Asia y que en 2050 el número total de ellas en todo el mundo alcanzará los 8,2 millones²⁸. El costo de prevenir las fracturas es casi igual al de tratarlas, y el...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1ml Sampler	Guangxi Beilunhe Medical Industrial Group Co.	JYQ001	For anesthesia in mice
4%polyformaldehyde	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P1110	For tissue fixation
6-0 absorbable suture (angled needle)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co.	HZX-06	For postoperative suturing
Absorbent cotton ball	Winner	MIANQIU-500g	For sterilization and hemostasis
Adhesive slides	Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co.	188105	For tissue sectioning
Amobarbital	Sigma Aldrich (Shanghai) Trading Co.	A-020-1ML	For anesthesia in mice
Bluing Solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1866	Blue coloration of the nuclei of cells after the action of hematoxylin differentiation solution
C57BL/6 mice	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	(SCXK 2033-0063)	For use in animal experiments
Carbon steel surgical blades	Premier Medical Equipment Co.	SP239	For mouse surgery
CIKS/TRAF3IP2 Rabbit pAb	BIOSS ANTIBODIES	bs-6202R	Binds to Act1 in tissues
Cole's Hematoxylin Solution (For Conventional Stain)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1140	For staining paraffin sections
Collagen Type I Polyclonal antibody	proteintech	14695-1-AP	Binds to COL-1 in tissues
DAB Substrate kit,20x	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	DA1010	For tissue color development
Disposable surgical sheet 50*60CM	Nanchang Xuhui Medical Equipment Co.	SP4529777	For mouse surgery
EDTA decalcification solution (pH 7.2)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	E1171-500ml	For tissue decalcification
Enhanced Endogenous Peroxidase Bloching Buffer	Beyotime Biotechnology	P0100B	Sequestration of tissue or cellular endogenous peroxidases
Environmentally friendly dewaxing clear liquid	Servicebio	G1128-1L	For dewaxing paraffin sections
Ethyl Alcohol	CHRON CHEMICALS	64-17-5 (CAS)	For dehydration of paraffin sections
General Purpose Antibody Diluent	Epizyme Biotech	PS119L	For antibody dilution
Hematoxylin Differentiation Solution	Servicebio	G1039-500ML	For differentiation after hematoxylin staining and removal of excessively bound and non-specifically adsorbed dye from tissues
Hematoxylin Eosin (HE) Staining Kit	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1120-3*100ml	For tissue staining
High quality stainless steel surgical knife handle	Premier Medical Equipment Co.	SP0088	For mouse surgery
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	proteintech	SA00001-2	Binds to primary antibody and amplifies signal
IL-17A Polyclonal antibody	proteintech	13082-1-AP	Binds to IL-17 in tissues
IL-6 Polyclonal antibody	proteintech	21865-1-AP	Binds to IL-6 in tissues
Immunohistochemistry pen	Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co.	ZLI-9305 (YA0310)	For drawing circles in immunohistochemistry
Medical surgical suture Non-absorbent (ball) 5-0 3.5m	Yangzhou Yuanlikang Medical Equipment Co.	FHX-5-2	For postoperative suturing
Medical Suture Needles Angle Needles 4*10 3/8	Chaohu Binxiong Medical Equipment Co.	FHZ612-4	For postoperative suturing
Neutral Balsam	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G8590	As a slice sealer
PBS(1X)	Shenzhen Mohong Technology Co.,Ltd	B0015	Buffer for slide washing and partial solution dilution
Protein Free Rapid Blocking Buffer (1X)	Epizyme Biotech	PS108P	Avoiding non-specific binding of proteins
Rabbit Anti-Bone Alkaline Phosphatase antibody	BIOSS ANTIBODIES	bs-6292R	Binds to alkaline phosphatase in tissues
Saline	Affiliated Hospital Youjiang Medical University For Nationalities	LHN500	For animals by gavage
Shaving/Electric clippers	HANGZHOU HUAYUAN PET PRODUCTS CO., LTD.	DTJ-002	For shaving mice
Stainless Steel Medical Needle Holder 14cm Coarse Needle	Premier Medical Equipment Co.	SP784	For mouse surgery
Stainless Steel Ophthalmic Forceps 10.5cm Curved (No Hook)	Zhuoyouyue	YKNWW-10.5	For mouse surgery
Stainless Steel Ophthalmic Scissors/Surgical Scissors 10CM Straight Tip	Premier Medical Equipment Co.	ZYJD-10-ZJ	For mouse surgery
Stainless Steel Tip Gastric Needle 12 Gauge 55mm Elbow		GWJ-12-55W	For use in mice by gavage
Tris-EDTA Antigen Repair Fluid (50x)	proteintech	PR30002	For antigen repair of paraffin sections
Wooden dissecting board 25*16cm		JP16*24	For mouse surgery
Xiaoyao pills	Jiuzhitang Co.,Ltd.	YPG-041	For animal drug delivery
Others
R 4.3.1			Data processing
Cytoscape3.9.1	National Resource for Network Biology		Building a regulatory network for traditional Chinese medicine
ImageJ 1.54f	National Institutes of Health		Image processing for immunohistochemistry results
Adobe Photoshop 24.0.0	Adobe		For image combination
GraphpadPrism 9.5	GraphPad Software		Statistical analysis of data
cellsens Dimension	OLYMPUS		For slicing and photographing
OLYMPUS BX53	OLYMPUS		For HE staining and immunohistochemical section photography