Farelerde Postmenopozal Osteoporoz Tedavisinde Xiaoyao Haplarının Anti-İnflamatuar Etkisi Üzerine Çalışmalar

Özet

Postmenopozal osteoporoz küresel bir halk sağlığı sorunu haline gelmiştir. Bu çalışmanın amacı, geleneksel Çin tıbbı Xiaoyao haplarının bu durum üzerindeki terapötik etkilerini ve ilgili mekanizmalarını araştırmaktır.

Özet

Osteoporoz, yaşlı ve menopoz sonrası kadınlarda sık görülen bir metabolik hastalıktır ve erken evrelerinde belirgin bir semptom göstermez. Bu durumun sonraki aşamalarında, hastalar kırıklara eğilimlidir ve bu onların sağlıklarını ve yaşam kalitelerini ciddi şekilde etkileyebilir. Dünya çapında yaşam beklentisindeki artış, osteoporozu küresel bir endişe haline getirmiştir. Xiaoyao hapları daha önce
depresyon tedavisinde kullanılır. Ek olarak, ilacın, erken osteoblasta özgü bir belirteç olan ALP'nin ve kemik hücre dışı matrisin önemli bir bileşeni olan COL-1'in ekspresyonunu etkileyen östrojen benzeri aktiviteye sahip olduğu ortaya çıktı. Xiaoyao hapları, farelerde menopoz sonrası osteoporoz (PMOM) üzerindeki etkileri açısından değerlendirildi. Xiaoyao haplarının her bir bitkisel bileşeninin hedef bilgilerine, Geleneksel Çin Tıbbı Sistemleri Farmakolojisi (TCMSP) veritabanı aracılığıyla erişildi. GeneCards, OMIM, PharmGkb, TTD, DrugBank ve diğer web sitelerinden gelen bilgiler, protein etkileşimlerini değerlendirmek için Cytoscape ve String ağı aracılığıyla bitkisel kompleksin düzenleyici ağını oluşturmak için kullanıldı. Fareler yumurtalıklı hale getirildi ve yüksek ve düşük dozlarda Xiaoyao hapları ile tedavi edildi ve bunlar kontrollerle karşılaştırıldı. Semptomları kemik dokularının immünositokimyası ile değerlendirildi. Sonuçlar, Xiaoyao haplarının, IL-17 sinyal yolu yoluyla yumurtalıklı farelerde PMOM semptomlarını hafifletme yeteneğine sahip olduğunu gösterdi. Bu ilaç, osteoporoz tedavisi için yeni bir terapötik ajan olma potansiyeline sahiptir.

Giriş

Dünya Sağlık Örgütü (WHO) osteoporozu (OP), kemik kütlesinde azalma ve kemik dokusunun mikro mimarisinin bozulması ile karakterize edilen, kemik kırılganlığında artışa ve dolayısıyla kırık riskinde artışa yol açan bir hastalık olarak tanımlamaktadır¹. Osteoporozun klinik önemi, yüksek mortalite, morbidite ve ekonomik maliyetlerle ilişkili kırıklara yol açabilmesidir². Menopoz sonrası osteoporoz (PMOP), menopoz sonrası kadınlarda östrojen seviyelerinin düşmesinden kaynaklanır, bu da osteoklast aktivitesinde artışa yol açarak kemik kaybı ve kemik mikro yapısının tahrip olmasına neden olur. Bu genellikle sağlık üzerinde ciddi bir etkisi olan osteoporoza neden olur³. PMOP için mevcut tedaviler östrojen replasman tedavisi, bifosfonatlar ve paratiroid hormonunu içerir, ancak bunlar değişen derecelerde yan etkilere, yetersiz uzun süreli uyuma ve yüksek maliyetlere sahip olabilir⁴. Bu nedenle, uygun fiyatlı bitkisel ilaçlar, nüfusun büyük bir kısmı için uygun bir alternatiftir.

Xiaoyao hapları Çin Farmakopesi^5'e dahil edilmiştir ve bunlar Chai Hu, Angelica sinensis, Beyaz paeonia lactiflora, Atractylodes macrocephala, Poria cocos, Menthae Herba, meyan kökü ve taze zencefil dahil olmak üzere sekiz bitkisel bileşen içerir. Tüm bu bitkilerin karaciğeri detoksifiye etmede ve dalağı güçlendirmede, kanı beslemede ve adet döngüsünü düzenlemede etkili olduğu bilinmektedir ve karışım ayrıca depresyon tedavisinde de kullanılmıştır⁶. Bununla birlikte, Xiaoyao haplarının osteoporozdaki rolü belirsizdir.

Erken çalışmalar, iltihabın kemik kaybına⁷ yol açabileceğini ve bu süreçle ilişkili kemik yoğunluğundaki düşüşün menopoz tarafından hızlandırılabileceğini öne sürmüştür. Ek olarak, osteoporoz gelişimi ile inflamasyon arasında güçlü bir ilişki vardır. İnflamatuar faktör, interlökin-17 (IL-17), CD4+ T lenfositlerinin bir alt kümesi olan Th17 hücreleri tarafından salgılanan bir proinflamatuar faktördür. Bu hücreler çeşitli kronik enflamatuar durumlarla ilişkilidir ve romatoid artritte kemik yıkımının gelişiminde önemli bir rol oynarlar⁸. Ek olarak, IL-17, osteoklastogenezi düzenleyen nükleer faktör-κ B ligand reseptör aktivatörünü (RANKL) uyarır ve kemik oluşumundan daha fazla kemik rezorpsiyonuna yol açar⁹. IL-17, TNFa, IL-1, IL-6 ve IL-8 gibi diğer osteoklastojenik sitokinlerin ekspresyonunu uyarır. Diğer enflamatuar faktörlerle sinerji oluşturma yeteneğine sahiptir, bu da onu önemli bir enflamatuar efektör yapar¹⁰.

Çalışmalar ayrıca Xiaoyao hapları ve iltihaplanma arasında bir bağlantı olduğunu göstermiştir. Shi ve ^ark.11 ve Fang ve ^ark.12 yakın zamanda Xiaoyao haplarının sırasıyla IL-6 ve TNF-α seviyelerini azaltabileceğini doğruladılar. Metabolizma ile ilişkili steatohepatit ile ilgili başka bir çalışmada, Xiaoyao haplarının propiyonik asit ekspresyonunu yukarı regüle edebileceği, bunun da TNF-α ekspresyonunu inhibe ettiği ve bir anti-enflamatuar etki gösterdiği bildirilmiştir¹³. Bununla birlikte, şu anda, Xiaoyao haplarının, bu çalışmanın amacı olan IL-17 yoluyla inflamatuar bir yanıta aracılık ederek PMOM gelişimini düzenleyip düzenleyemeyeceği bilinmemektedir.

Bu çalışma, ağ farmakolojisi ve biyoinformatik analizi yoluyla Xiaoyao haplarının ve osteoporozla ilişkili genlerin hedeflerinin kesişimini öngördü ve protein etkileşimleri, GO ve KEGG için kesişen genleri analiz etti. Tahmin edilen sonuçlara dayanarak, IL-17 sinyal yolundaki anahtar proteinler olan Act1 ve IL-6'nın ekspresyonu^{gözlemlenebilir 14,15}, ayrıca kemik döngüsü belirteçleri alkalin fosfataz (ALP) ve kollajen tip I (COL-1), PMOM fareleri modelindeki Xiaoyao haplarının terapötik etkinliğini gözlemlemek için.

Protokol

Youjiang Milliyetler Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Etik Komitesi çalışma protokolünü onayladı (onay numarası: 2022101502). 10-12 haftalık yaşlarında, SPF sınıfında ve vücut ağırlıklarında (22 ± 2) g olan dişi C57BL / 6 fareleri, Youjiang Tıp Üniversitesi Milliyetler için SPF Sınıfı Hayvan Deney Merkezi'ne yerleştirildi. Deney hayvanları 24-26 °C sıcaklıkta ve %55 ila %60 bağıl nemde tutuldu.

1. Geleneksel Çin tıbbı sistemleri, farmakoloji veritabanı ve analiz platformu

NOT: Geleneksel Çin Tıbbı Sistemleri Farmakoloji Veri Tabanı ve Analiz Platformu (TCMSP; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php), TCM bileşenleri, ADME ile ilgili özellikler, hedefler ve hastalıklar hakkında Bilgi içeren Çin tıbbı farmakoloji platformlarıdır^16,17.

1. TCMSP web arayüzüne erişin. Herb'in adını arayın, Çin tıbbının adını girin ve Ara'yı tıklayın. Arama sonuçlarında Latin Adı'na tıklayın. OB ≥ %30 ve DL ≥ 0.18 parametreleri ile bileşenlerin sonuçları üzerinde tarama yapın.
2. Tüm sonuçları kopyalayın ve Çin Tıbbı Name_ingredients.txt adlı TXT formatında kaydedin.
3. İlgili Hedefler sekmesindeki Hedef Bilgileri altında, Mol Kimliği (yani, adım 1.2'deki sonuç) için filtreleyin.
4. Filtrelenmiş sonuçları kopyalayın ve Çin Tıbbı Name_targets.txt adlı TXT biçiminde kaydedin.
   NOT: Yukarıdaki adımlar aracılığıyla, geleneksel Çin tıbbının (TCM) tüm uygun aktif bileşenleri ve ilgili hedef bilgileri elde edildi.
5. Yukarıdaki tüm ingredients.txt dosyalarını ve targets.txt dosyalarını aynı klasöre yerleştirin ve Perl betiklerini (Ek Kodlama Dosyası 1) bu klasöre yerleştirin.
6. CMD'yi açın, cd klasör yolunu yazın, girin ve Perl betiğini çalıştırın. Yeni bir metin dosyası (allTargets.txt) alın. Bu yeni metin dosyası (allTargets.txt) bitkisel adı, içerik adını, içerik kimliğini ve hedefi içerir.

2. UniProt veritabanı

NOT: UniProt veritabanı (https://www.uniprot.org/), fonksiyonel bilgilerle açıklamalı insan protein dizilerini içerir ve hedeflerin adlarını resmi adlarına¹⁸ normalleştirmek için kullanılır.

1. UniProt'a gidin web arayüz. Ara sekmesine tıklayın, UniProtKB'yi seçin ve Ara'ya tıklayın.
2. Filtreleyin, Sol kenar çubuğunda Durum için İncelendi (İsviçre-Prot) ve Popüler organizmalar için İnsan'ı seçin. İndir'e tıklayın, Tümünü İndir'i seçin, Biçim için TSV'yi seçin ve ek açıklama dosyasını indirmek için İndir'e tıklayın.
3. İndirilen dosyayı geçerli klasöre açın, sıkıştırılmış dosyayı açın ve ann.txt adlı bir metin dosyasına kopyalayıp yapıştırın.

3. İlaç hedef kimliği dönüşümü

1. Bölüm 1'de elde edilen tüm ilaç hedef dosyalarını allTargets.txt ve bölüm 2'de elde edilen UniProt açıklama dosyasını ann.txt bir klasöre koyun ve Perl betiklerini (Ek Kodlama Dosyası 2) içine koyun.
2. CMD'yi açın, cd + boşluk + klasör yolu yazın, girin ve yeni bir metin dosyası (allTargets.symbol.txt) elde etmek için Perl betiğini çalıştırın. Bu yeni metin dosyası (allTargets.symbol.txt) bitkisel adı, içerik kimliğini, içerik adını ve gen kimliğini içerir.

4. Veritabanı araması

1. GeneCards: İnsan Gen Veritabanı (GeneCards) veritabanı
   NOT: GeneCards veritabanı (https://www.genecards.org/), insan genleri için tahmin ve açıklama bilgileri sağlar. Hastalık hedeflerine erişmek için kullanılır^19,20.
   1. GeneCards web arayüzüne gidin. Arama kutusuna osteoporoz yazın ve Ara'yı tıklayın.
   2. Dışa Aktar'a tıklayın ve Excel'e Aktar'ı seçin.
   3. İndirilen dosyayı açın, Alaka düzeyi puanı ≥ 1 olan genleri kopyalayın ve bunları GeneCards.txt adlı bir dosyaya yapıştırın ve kaydedin.
2. OMIM veritabanı
   NOT: OMIM veri tabanı (https://omim.org) insan genlerini, genetik hastalıkları ve özelliklerini^{içerir 21}.
   1. OMIM web arayüzüne gidin. GENE Map'e tıklayın, arama kutusuna osteoporoz yazın ve Ara'ya tıklayın.
   2. Farklı İndir'e tıklayın ve Excel Dosyası'nı seçin.
   3. İndirilen dosyayı açın, Onaylanan Sembol sütunundaki gen adını kopyalayın, yapıştırın ve OMIM.txt adlı bir dosyaya kaydedin.
3. PharmGkb veritabanı
   NOT: Farmakogenomik bilgi tabanı olan PharmGkb (https://www.pharmgkb.org), ilaç etiketi açıklamalarını, ilaç merkezli yolları, farmakogenetik özetleri ve genler, ilaçlar ve hastalıklar arasındaki ilişkileri içerir²².
   1. PharmGkb web sitesi arayüzüne gidin. Arama kutusuna osteoporoz yazın, Ara'yı tıklayın ve sol kenar çubuğunda Gen'i işaretleyin.
   2. Tüm sonuçları manuel olarak girin ve PharmGkb.txt adlı bir dosyaya kaydedin.
4. TTD: Terapötik Hedef Veri Tabanı (TTD) veritabanı
   NOT: TTD veri tabanı (https://idrblab.org/ttd/), protein ve nükleik asit hedefleri, hedeflenen hastalıklar, yol bilgileri ve her^{hedef 23} için karşılık gelen ilaçlar hakkında bilgi sağlar.
   1. TTD web arayüzüne gidin. Arama kutusuna osteoporoz yazın ve Ara'yı tıklayın.
   2. Sonuçta Hedef Kimliği altında Hedef Bilgileri'ne tıklayın, Hedef Adı'nı kopyalayın, yapıştırın ve TTD.txt adlı bir dosyaya kaydedin. Toplam 33 sonuç elde edildi. Her sonucu aynı şekilde kaydedin.
5. DrugBank Online (DrugBank) veritabanı
   NOT: DrugBank veri tabanı (https://go.drugbank.com) ilaçlar ve ilaç hedefleri, ilaç etkileşimleri, ilaç mekanizmaları ve ilaç metabolizması hakkında bilgi içerir²⁴.
   1. DrugBank web sitesi arayüzüne gidin. Arama sekmesinde Endikasyonlar'ı seçin, arama kutusuna osteoporoz yazın ve Ara'ya tıklayın.
   2. Daha fazla bilgi için sonuçlardaki Osteoporoz girişine tıklayın, İLAÇLAR VE HEDEFLER sekmesine tıklayın ve tablonun HEDEF sütunundaki Uygun Bağlantıya tıklayın.
   3. Protein'de Ayrıntılar'a tıklayın, Gen Adı'nı kopyalayın, yapıştırın ve DrugBank.txt adlı bir dosyaya kaydedin. Her sonucu aynı şekilde kaydedin.

5. Venn şeması

1. Hastalıkla ilişkili gen birleştirme ve Venn haritalama
   1. Kaydedilen txt dosyalarını ve komut dosyasını aynı klasöre koyun.
   2. R kodunu (Merge Disease-Related Genes) açınız, yukarıdaki txt dosyasının saklandığı yolu kopyalayıp R kodunda setwd'nin bulunduğu satıra yapıştırın.
   3. R yazılımını açın, değiştirilen R kodunu çalıştırın ve kaydedin. Geni ayarlayın, dosyayı Disease.txt adlandırın.
   4. Venn Şeması Çiz web sitesini açın; giriş bölümünde, 4 ila 8. bölümlerde kaydedilen metin içeriğini kopyalayıp listeye tek tek yapıştırın, ilgili veritabanıyla adlandırın ve Gönder'e tıklayın.
   5. Resmin altındaki Resmi PNG Olarak Kaydet'e tıklayın ve metin sonucunu aynı klasöre kaydedin.
2. İlaç hedeflerinin ve hastalıkla ilişkili genlerin kesişimi
   1. Bölüm 3'te elde edilen allTargets.symbol.txt dosyasını ve adım 5.1.3'te elde edilen Disease.txt dosyasını aynı klasöre yerleştirin.
   2. R kodunu (ilaç hedefi ve hastalığa bağlı gen alma kesişimi) açınız, yukarıdaki txt dosyasının saklandığı yolu R kodunda setwd'nin bulunduğu satıra kopyalayıp yapıştırın.
   3. R yazılımını açın, değiştirilen R kodunu çalıştırın ve kaydedin. Geni ayarlayın, dosyayı Drug_Disease.txt adlandırın.
   4. Venn Şeması Çiz web sitesini açın. Giriş bölümünde, allTargets.symbol.txt kopyalayıp yapıştırın ve listeye Disease.txt ve ilgili dosyalarının adını verin.
   5. Resmin altındaki Resmi PNG Olarak Kaydet'i tıklatın ve metin sonuçlarını aynı klasöre kaydedin.

6. TCM bileşiminin düzenleyici ağının inşası

1. Bölüm 3'te elde edilen allTargets.symbol.txt dosyasını, Disease.txt dosyası ve karşılık gelen Perl betiği (Ek Kodlama Dosyası 3) ile aynı klasöre yerleştirin.
2. CMD'yi açın, cd dosya yolunu yazın, Enter'a basın ve Perl betiğini çalıştırın. Dört yeni txt dosyası edinin: net.geneLists.txt, net.molLists.txt, net.network.txt ve net.type.txt. network.txt dosyası, TCM bileşen kimliğini, hedef genini, hedef ilişkisini ve bileşen adını içerir. net.type.txt düğüm adını, özniteliklerini ve ilişkisini içerir. net.geneLists.txt genlerin listesidir ve net.molLists.txt bileşenlerin listesidir.
3. Yeni alınan metin dosyalarını aynı yeni klasöre kopyalayın.
4. Cytoscape 3.9.1 yazılımını açın, Dosya'ya tıklayın, İçe Aktar'a tıklayın ve Ağ Formu Dosyası'nı seçin. net.network.txt'yi seçin, Bileşen Kimliği'nin ilk sütununu Kaynak Düğüm olarak, Genler'in ikinci sütununu Hedef Düğüm olarak ve Hedefleme İlişkisi'nin üçüncü sütununu Etkileşim Türü olarak yerleştirin ve Tamam'a tıklayın.
5. Düğüm Tablosu penceresinden net.type.txt içe aktarın. Seç sekmesine tıklayın, Düğümler'i seçin, Kimlik Listesi Dosyasından'ı seçin , net.geneLists.txt'yi seçin ve Aç'a tıklayın.
6. Düzen sekmesine tıklayın, Derece Sıralanmış Daire Düzeni'ni seçin ve Yalnızca Seçili Düğümler'i seçin. Düğümlerin hem yüksekliğini hem de genişliğini 70 olarak ayarlayın.
7. Yükseklik'teki İkinci Kutu'ya tıklayın, Sütun'da degree.layout'u seçin, Eşleme Türü'nde Sürekli Eşleme'yi seçin ve yüksekliğin üst ve alt sınırlarını uygun bir aralığa ayarlamak için Geçerli Eşleme'nin sağ tarafındaki Yükseklik Ayarlama Penceresi'ne çift tıklayın.
8. Genişlik seçeneği ile işlemi tekrarlayın.
9. Layout ( Düzen ) sekmesini tekrar tıklatın ve Layout Tools (Düzen Araçları) > Adjust the Scale (Ölçeği düğümler çakışmayacak şekilde ayarla) seçeneğini tıklatın.
10. Düğüm ağını işaretli hale getirmek için yazılımın Sağ Üst Penceresine tıklayın, Seç sekmesine tıklayın, Düğümler'i seçin, Kimlik Listesi Dosyasından'ı seçin, net.molLists.txt'yi seçin ve Aç'a tıklayın.
11. Düzen sekmesine tıklayın, Grup Öznitelik Düzeni'ni seçin, Yalnızca Seçili Düğümler'i seçin ve Tür'e tıklayın.
12. Sol sütunda Etiket Yazı Tipi Boyutu'na tıklayın ve Varsayılan Değer'i 12 olarak ayarlayın. Sol sütundaki Image/Chart 1'de Varsayılan Değer'e tıklayın.
13. Açılan pencerede Grafikler'i seçin, Pasta Grafik'e tıklayın ve Kullanılabilir Sütunlar sütununda derece hariç Öğeler'i seçin. Seçili sütunlar sütununda düzen oluşturun ve Uygula'yı tıklayın.
14. Sol sütundaki Kenarlık Boyası'na tıklayın ve Varsayılan Değeri #003EF8 olarak ayarlayın. Sol kenar çubuğunun altındaki Kenar sekmesine tıklayın ve Genişlik'i 0.8 olarak ayarlayın.
15. Üst araç çubuğunda Dosya'ya tıklayın, Dışa Aktar'ı ve ardından Ağdan Görüntüye'yi seçin.
16. Açılır pencerede, Biçim için PNG formatını seçin, kaydetme dizinini seçin ve görüntü ağını adlandırın, Görüntü Boyutunu Yakınlaştır'ı maksimum %500'e ayarlayın, Saydam Arka Plan'ı seçin ve görüntüyü kaydetmeyi tamamlamak için Tamam'a tıklayın.

7. Protein-Protein Etkileşim Ağları (PPI) yapıları

1. STRING web sitesini (https://string-db.org/) açın, Çoklu Protein'e tıklayın, Dosya yükle'de Gözat'a tıklayın, adım 5.2.3'te alınan Drug_Disease.txt dosyasını seçin ve Organizmalar'da Homo sapiens'i seçin. Ara'ya tıklayın ve Devam'a tıklayın.
2. Ayarlar'a tıklayın, gereken minimum etkileşim puanını en yüksek güvenirliğe (0,900) ayarlayın ve ağ görüntüleme seçeneklerinde Ağdaki Bağlantısı Kesilen Düğümleri Gizle'yi işaretleyin. Güncelle'ye tıklayın.
3. Çakışma veya tıkanma olmaması için ağ diyagramındaki düğümlerde ayarlamalar yapın.
4. Protein birlikte çalışan ağ haritasını PNG formatında almak için Dışa Aktar'a tıklayın ve Yüksek çözünürlüklü bir bitmap olarak indir'e tıklayın. Ayrıca, TSV dosyasını kısa bir tablo metni çıktısı olarak indirin. Her iki dosyayı da birleşik bir klasöre kaydedin. TSV dosyası, gen adını, STRING dahili kimliğini ve farklı öznitelikler için puanları içerir.

8. ÜFE ağ çekirdeği yapısı

1. Bölüm 7'de elde edilen TSV dosyasını ve gerekli Perl betiklerini yeni bir klasöre yerleştirin.
2. Cytoscape 3.9.1 yazılımını açın, Dosya'ya tıklayın, İçe Aktar'ı seçin, Dosyadan Ağ'a tıklayın, Yukarıdaki TSV dosyasını seçin, ilk sütun düğüm1'i Kaynak Düğüm ve ikinci sütun düğüm2'yi Hedef Düğüm olarak koyun ve Tamam'a tıklayın.
3. Sol kenar çubuğunda Stil'i tıklayın, Genişlik'te Varsayılan Değer'i tıklayın ve 60 olarak ayarlayın. Ağda çakışma ve tıkanıklık olmaması için düğümleri sürükleyip bırakın.
4. Üst araç çubuğunda APP'lere tıklayın, CytoNCA'ya tıklayın ve Aç'a tıklayın.
5. Sol sütunda, Aradalık, Yakınlık, Derece, Özvektör, Yerel Ortalama Bağlantı tabanlı yöntem ve Ağ altında Ağırlıksız'ı seçin ve Analiz Et'e tıklayın.
6. Analiz tamamlandığında, sağ alt penceredeki Düğüm Tablosu'na tıklayın, Dışa Aktar'a tıklayın, klasöre kaydedin ve puan 1 olarak adlandırın.
   NOT: CytoNCA eklentisinin Cytoscape yazılımına yüklenmesi gerekir. Bunu yapmak için, üst araç çubuğunda Uygulamalar'a tıklayın, APP Manager'a tıklayın, arama kutusuna CytoNCA yazın, döndürülen sonuçların orta sütununda CytoNCA'yı işaretleyin ve Yükle'ye tıklayın.
7. score1'i açın, ad sütununu ilk sütuna ayarlayın, tablodaki bilgileri kopyalayın, yeni bir metin dosyasına yapıştırın, score1.txt adlandırın ve kaydedin.
8. R kodunu açın ve score1.txt dosyasının bulunduğu yolu kopyalayıp R kodunda setwd'nin bulunduğu satıra yapıştırın.
9. R yazılımını açın ve score2.txt ve score2.gene.txt olmak üzere iki yeni dosya almak için değiştirilen kodu çalıştırın. score2.txt dosyası, tüm program puanlarının medyandan büyük olduğu genleri ve her program için spesifik puanları içerir. score2.gene.txt, tüm öğeler için medyandan daha yüksek puan alan genleri içerir.
10. Cytoscape'te devam etmek için sağ alt pencerede AnalysisPanel 1'e tıklayın, pencerenin sol tarafındaki Dosyadan Yükle'ye tıklayın, score2.gene.txt seçin, Aç'a tıklayın ve açılan pencerede Tamam'a dokunun.
11. En alttaki Düğümleri Seç'e tıklayın ve açılan pencerede Tamam'a tıklayın.
12. Üst araç çubuğunda Dosya'ya tıklayın, Dışa Aktar'ı seçin, Ağdan Görüntüye'ye tıklayın, Görüntü Boyutu'ndaki Yakınlaştırma (%) değerini maksimum %500'e ayarlayın, Saydam Arka Plan'ı işaretleyin ve dosyayı aynı klasöre kaydedin, ağ1 olarak adlandırın.
13. Bir alt ağ oluşturmak için alt pencerenin sağ kenar çubuğunda Alt Ağ Oluştur'a tıklayın, alt ağı analiz edin, üstteki araç çubuğunda APP'lere tıklayın, CytoNCA'ya tıklayın ve Aç'a tıklayın.
14. Sol kenar çubuğunda, Aradalık, Yakınlık, Derece, Özvektör, Yerel Ortalama Bağlantı tabanlı yöntem ve Ağ altında Ağırlıksız'ı seçin ve Analiz Et'i tıklayın.
15. Analiz tamamlandığında, sağ alt pencerede Node Table'a tıklayın, Dışa Aktar'a tıklayın ve score2 adlı yeni bir klasöre kaydedin.
16. Score2'yi açın, ad sütununu ilk sütuna ayarlayın, tablodaki bilgileri kopyalayın, yeni bir metin dosyasına yapıştırın, score2.txt adlandırın ve kaydedin.
17. R kodunu açın ve score2.txt dosyasının bulunduğu yolu kopyalayıp R kodunda setwd'nin bulunduğu satıra yapıştırın.
18. R yazılımını açın ve iki yeni dosya almak için değiştirilen kodu çalıştırın: score3.txt ve score3.gene.txt. score3.txt dosyası, tüm öğeler için medyandan daha yüksek puan alan genleri ve her öğe için belirli puanları içerir. score3.gene.txt, tüm öğeler için medyandan daha yüksek puan alan genleri içerir.
19. Cytoscape'te devam etmek için sağ alt pencerede AnalysisPanel 1'e tıklayın, pencerenin sol tarafındaki Dosyadan Yükle'ye tıklayın, score3.gene.txt seçin, Aç'a tıklayın ve açılan pencerede Tamam'a dokunun.
20. En alttaki Düğümleri Seç'e tıklayın ve açılan pencerede Tamam'a tıklayın.
21. Üst araç çubuğunda Dosya'ya tıklayın, Dışa Aktar'ı seçin, Görüntüye Ağ'a tıklayın, Görüntü Boyutu'nda Yakınlaştırma (%) öğesini %500 olarak ayarlayın, Saydam Arka Plan'ı işaretleyin ve dosyayı bu adımda kullanılanla aynı klasöre kaydedin ve ağ2 olarak adlandırın.
22. Bir alt ağ oluşturmak için aşağıdaki pencerenin sağ kenar çubuğunda Alt Ağ Oluştur'a tıklayın.
23. Üstteki araç çubuğunda Dosya'ya tıklayın, Dışa Aktar'ı seçin, Ağdan Görüntüye'ye tıklayın, Görüntü Boyutu'ndaki Yakınlaştırma (%) değerini maksimum %500'e ayarlayın, Saydam Arka Plan'ı işaretleyin ve dosyayı bu adımda kullanılanla aynı klasöre kaydedin ve ağ3 olarak adlandırın.

9. Gen Kimliği Dönüşümü

1. Drug_Disease.txt dosyasını gerekli kod dosyasıyla aynı yeni klasöre yerleştirin.
2. R kodunu (Supplementary Coding File 4) açın ve R kodunda setwd'nin bulunduğu satıra Drug_Disease.txt dosyasının bulunduğu yolu kopyalayıp yapıştırın.
3. R yazılımını açın, org'u kullanarak değiştirilen kodu çalıştırın. Hs.eg.db gen kimliğini dönüştürmek için paket oluşturur ve yeni bir dosya tamamlandıktan sonra id.txt çalışır. id.txt, genin sembolünü ve karşılık gelen kimliği içerir.

10. GO zenginleştirme analizi

1. Önceki adımdaki id.txt dosyasını GO zenginleştirme analiz koduyla aynı klasöre yerleştirin.
2. R kodunu (Ek Kodlama Dosyası 5) açın ve çalışma dizinini id.txt ve GO kodunun depolandığı yol olarak ayarlayın.
3. R yazılımını açın, değiştirilen kodu çalıştırın ve clusterProfiler, org komutunu kullanın. Hs.eg.db, grafiği, ggplot2 grafiğini, GO zenginleştirme analizi histogramlarını ve kabarcık grafiklerini zenginleştirin. Çalıştırma tamamlandıktan sonra GO.txt, barplot.pdf ve bubble.pdf olmak üzere üç yeni dosya alın.
   NOT: GO.txt, zenginleştirme sınıflandırması (BP, CC, MF), GO ID, GO adı, gen oranı, arka plan oranı, zenginleştirme önemi p-değeri, düzeltilmiş p-değeri (p.adjust, değer), gen kimliği (isim) ve her GO'da zenginleştirilen gen sayısını içeren zenginleştirme sonuç dosyasıdır. barplot.pdf histogram, baloncuktur. PDF bir baloncuk grafiğidir.

11. KEGG zenginleştirme analizi

1. id.txt dosyasını KEGG zenginleştirme analiz koduyla aynı klasöre yerleştirin.
2. R kodunu (Ek Kodlama Dosyası 6) açın ve çalışma dizinini id.txt ve KEGG kodunun depolandığı yola ayarlayın.
3. R yazılımını açın, değiştirilen kodu çalıştırın ve clusterProfiler, org komutunu kullanın. GO zenginleştirme analizi histogramlarını, kabarcık grafiklerini ve yol grafiklerini çizmek için Hs.eg.db, enrichplot, ggplot2 paketi. Çalıştırma, KEGG.txt, barplot.pdf ve bubble.pdf olmak üzere üç yeni dosyanın üretilmesiyle tamamlanır.
   NOT: KEGG.txt dosyası, yol kimliği, yol açıklaması, gen oranı, arka plan oranı, zenginleştirme önemi p-değeri, düzeltilmiş p-değeri (p.adjust, qvalue), gen kimliği (ad) ve her yolda zenginleştirilmiş gen sayısını içeren bir zenginleştirme sonuç dosyasıdır. barplot.pdf bir çubuk grafiktir ve bubble.pdf bir kabarcık grafiğidir.
4. KEGG.txt dosyasında IL-17'yi arayın; Sonuç, tek bir yol olduğunu gösteriyor; yol kimliğini kopyalayın.
5. R kodunu açın, IL-17 yol kimliğini KEGGID'ye yapıştırın ve yol haritasını etiketlemek için yol görünümü paketini kullanın. Değiştirilen R kodunu çalıştırın ve hsa04657.pathview.png ve hsa04657.png olmak üzere iki yeni dosya alın.
   NOT: hsa04657.png dosyası yol haritasıdır, hsa04657.pathview.png etiketli yol haritasıdır ve kırmızı ile etiketlenenler etkileşimler ağında bulunan genlerdir.

12. Xiaoyao haplarının hazırlanması

NOT: Kullanılan hazırlama yöntemi için Çin Farmakopesi^5'e bakın.

1. 100 gr Chai Hu, 100 gr Angelica sinensis, 100 gr Beyaz Paeonia lactiflora, 100 gr tavada kızartılmış Atractylodes macrocephala, 100 gr Poria cocos, 80 gr Radix glycyrrhizae preparat ve 20 g Menthae herba alın.
2. Bir taş değirmen veya toz haline getirme makinesi kullanarak, bitkileri ince bir toz haline getirin; Birkaç bitki yukarıdaki oranlarda birleştirilir ve doğal olarak birbirine karışmak için ince bir toz haline getirilir. İç çapı 180 μm ± 7.6 μm olan 80 gözenekli bir ilaç süzgeci kullanın ve toz haline getirilmiş tozu süzün. İyice karıştırın.
3. 100 gr zencefil alın, su ekleyin ve her seferinde 20 dakika 2 kez kaynatın. Süzün ve bir kenara koyun.
4. Tıbbi bir plak alın, küçük bir süpürgeyi zencefilli suya batırın, plağın üzerine fırçalayın, yukarıdaki tozu alın, zencefilli suyun üzerine serpin ve plağı tüm tozun ıslanması ve bir top şeklinde kalıplanabilmesi için çevirin.
   NOT: Tıbbi plağın oluşumu, TCM haplarının hazırlanması sırasında önemli bir adımdır. Moso bambunun çoğu şeritlere bölünecek ve bir iskelet haline getirilecektir. Bambu derisi veya tengpi yüzeye dokunur ve yuvarlaklaşır. Plakanın yüzeyi ince bir şekilde tung yağı ile kaplanmalı ve ardından bir vernik tabakası ile fırçalanmalıdır. Bu, su geçirmez hale gelmek için kurutulur. Bu şekilde yapılan haplar yuvarlak ve pürüzsüz olacaktır.
5. Zencefil suyunu tekrar fırçalayın, tozu serpin ve ilacın yavaş yavaş yuvarlanması ve büyümesi için plağı döndürün. Kurutma için serin bir yere koyun.

13. Hayvan modelinin kurulması

1. 7 günlük iklimlendirmeden sonra, deney farelerini rastgele olarak 4 gruba ayırın, yani sahte operasyon grubu (sadece yumurtalıkların etrafındaki yağın çıkarıldığı Sham) ve bir model grubundan oluşan üç yumurtalıklı fare grubu (OVX) ve düşük ve yüksek konsantrasyonlu Xiaoyao hapları uygulama grupları.
2. Fareleri intraperitoneal olarak enjekte edilen% 3 sodyum pentobarbital (40 mg / kg) ile uyuşturun. Genelleştirilmiş kas gevşemesini, derin ve yavaş nefes almayı ve yavaş hareketi gözlemleyerek farelerin anestezi durumuna girip girmediğini kontrol edin. Ameliyattan önce farelerin gözlerine göz merhemi sürün.
3. Hayvanları yüzüstü pozisyona getirin ve sırtın böbrek bölgesini bir hayvan tıraş makinesi ile tıraş edin. % 75 etanol ile yerel dezenfeksiyon yapın.
4. Böbreğin dorsal bölgesine yakın, bilateral olarak yaklaşık 1 cm'lik uzunlamasına bir kesi yapın ve kasları ve peritonu ayırmak için fasyayı kesin.
5. Ligasyon için uterus boynuzunun üst kısmını ve fallop tüplerini bulun. Keşif için insizyona forseps yerleştirin ve yumurtalığı uterus boynuzuna²⁵ bağlayan, yumurtalığın altında spiral olarak düzenlenmiş fallop tüpleri ile parlak kırmızı karnabahar deseninde yağ dokusu ile kaplanmış yumurtalığı bulun. Yumurtalıkları cerrahi makas ve dikiş ile çıkarın.
6. Sahte operasyon grubunda kontrol olarak yumurtalık yakınında az miktarda yağ dokusu alın. Bilinçlerini geri kazanana kadar hayvanları gözlemleyin. Ameliyat sonrası hayvanları tamamen iyileşene kadar ayrı kafeslere koyun.
7. Enfeksiyonu önlemek için, ameliyat sonrası 3 gün boyunca farelere gentamisin sağlayın. Operasyondan sonra, farelerin gerçek durumuna göre normal bir diyet ve iyi bir büyüme ortamı sağlayın. Yara enfeksiyonu veya iştahsızlık gibi herhangi bir anormallik varsa, derhal Laboratuvar Hayvanları Merkezi eğitmenine danışın.

14. İlaç tedavisi

NOT: Farmakoloji Deneysel Metodolojisi^26'ya göre, kullanılan insan ve hayvan dozajlarının dönüşümü, 70 kg'lık bir yetişkin için 9 g Xiaoyao hapıydı, bu da bir doza eşdeğerdir (tek bir uygulama için dozaj).

1. Düşük ve yüksek doz grupları için, 8 hayvandan oluşan bir grup için sırasıyla 0.683 g / kg ve 2.73 g / kg kullanın. Fareyi hareketsiz hale getirmek için sol elinizi kullanın, böylece farenin ağzı yemek borusu ile düz bir çizgide olur. Gavaj iğnesini sağ elinizde tutarak, farenin ağzının köşesinden farenksin arka duvarı boyunca yemek borusuna nazikçe sokun.
2. Bu noktada, gavaj iğnesinin yönü, indüklenmiş bir yutma eylemini uyarmak için hafifçe değiştirilebilir. İlacı enjekte edin. Bunu 12 hafta boyunca günde bir kez yapın.
3. Sahte olarak işletilen ve model grupları için, hayvanın ağırlığına göre belirlenen bir miktarda 12 hafta boyunca günde bir kez salin uygulayın.
4. Fareleri servikal çıkık ile ötenazi yapın ve arka bacaklarını kırpın. Kası femurdan ayırmak için uzuvların derisini deri. Farelerin femurlarını 1 ay boyunca EDTA dekalsifikasyon solüsyonu ile tedavi edin ve her gün taze solüsyonla değiştirin.

15. Hematoksilen-eozin boyama (HE) boyaması

1. Femoral dokuları 8 dakika mumdan arındırın ve ardından 3 dakika boyunca gradyan etanole koyun; Akan su ile 1 dakika durulayın.
2. Dokuyu tamamen kaplayacak şekilde bölümlere damla damla Hematoksilen boyama solüsyonu ekleyin, 5 dakika boyayın ve musluk suyu ile yıkayın
3. Hidroklorik asit farklılaştırma solüsyonunu slayt üzerindeki dokuya ekleyin ve dokuyu tamamen kapladığından emin olun. Dokuda renk değişikliği gözlendiğinde durun. Musluk suyu ile durulayın.
4. Eozin boya solüsyonunu damla damla ekleyin ve dokuyu tamamen kaplamaya izin verin, 30 s ila 2 dakika arasında hareket edin. Fazla boyayı akan su ile durulayın.
5. 5 dakika boyunca %75 susuz etanol ile gradyan etanol dehidrasyonu gerçekleştirin, ardından 5 dakika susuz etanol uygulayın ve 3 dakika boyunca mum alma solüsyonu kullanarak temizleyin.
6. Dokunun boyutuna göre lam üzerine uygun miktarda nötr sakız damlatın ve hava kabarcıklarından kaçınarak lamel dikkatlice indirin.

16. Mikro-BT ve İmmünohistokimya analizi

1. Farklı fare gruplarından femur örneklerinin etrafındaki fazla kasları ve bağları çıkarın ve örnek dokuları 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin.
2. Kemik dokularını havayla kurutun ve üç boyutlu mikro-BT verileri elde etmek için kemik dokusu taraması ile mikro-BT gerçekleştirin.
3. Korunmuş fare balmumu bloklarından 6 μm kalınlığında sürekli bölümler halinde kesin ve dilimleri 70 °C -72 °C'de 30-60 dakika pişirin.
4. 8 dakika mumdan arındırın, ardından 5 dakika boyunca %75 susuz etanol işlemi, 5 dakika susuz etanol ve 3x için 5 dakika PBS durulayın.
5. 15 dakika boyunca EDTA yüksek basınçlı onarım gerçekleştirin, ardından 5 dakika boyunca 3x PBS yıkama yapın.
6. Dokuya damla damla% 3 hidrojen peroksit ekleyin, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin ve PBS ile 5 dakika 3 kez yıkayın.
7. Bir daire çizmek için bir immünohistokimya kalemi kullanın. PBS ile yıkayın, 3 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
8. Birincil antikorda leke (anti-ALP tavşan pAb (1:200), anti-COL-1 tavşan pAb (1:200), anti-IL-17 tavşan pAb (1:275), anti-Act1 (1:500), anti-IL-6 tavşan pAb (1:500)) gece boyunca, ardından 3x boyunca 5 dakika boyunca PBS tamponu durulayın.
9. İkincil antikoru (HRP konjuge Affinipure Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L; 1:2000)) damla damla ekleyin ve oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin. PBS tamponu ile 3 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
10. DAB'da kullanıma hazır olarak 3-5 dakika inkübe edin, ardından PBS ile durulayın.
11. Hematoksilen yeniden boyama işlemini 3 dakika boyunca gerçekleştirin, ardından PBS durulayın.
12. Yaklaşık 10 saniye boyunca farklılaştırma solüsyonu kullanın, ardından PBS durulayın.
13. 10 saniye boyunca dönüş mavisi solüsyonu ekleyin, ardından PBS durulayın.
14. 5 dakika boyunca %75 susuz etanol işlemi, 5 dakika susuz etanol işlemi gerçekleştirin ve 3 dakika temizleyin. Slaytları kapatmak için nötr reçine kullanın.

Sonuçlar

Xiaoyao haplarının aktif bileşenleri ve etki hedefleri
TCMSP veri tabanında arama yaparak ve oral biyoyararlanım (OB) %30'≥ ve ilaç benzeri özellikler (DL) ≥ 0.18 kriterlerine göre tarama yaparak, Xiaoyao haplarında 125 aktif bileşen bulundu. Bunlar arasında 6, 4, 9, 13, 2, 6, 83 ve 2 numaralı maddeler sırasıyla Beyaz Paeonia lactiflora, Atractylodes macrocephala, Menthae herba, Chaihu, Angelica sinensis, Poria cocos, meyan kökü ve zence...

Tartışmalar

İstatistiklere göre, osteoporoz Amerika Birleşik Devletleri'nde her yıl 1,5 milyon kırığa neden olmaktadır ve bunların büyük çoğunluğu menopoz sonrası kadınlarda görülmektedir²⁷. Yaşlanan nüfusun artmasıyla birlikte, dünyada gelecekteki kalça kırıklarının büyük çoğunluğunun Asya'da meydana geleceği ve 2050 yılına kadar dünya genelinde bunların toplam sayısının 8,2 milyona ulaşacağı öngörülmektedir²⁸. Kırıkları önlemenin mali...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1ml Sampler	Guangxi Beilunhe Medical Industrial Group Co.	JYQ001	For anesthesia in mice
4%polyformaldehyde	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P1110	For tissue fixation
6-0 absorbable suture (angled needle)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co.	HZX-06	For postoperative suturing
Absorbent cotton ball	Winner	MIANQIU-500g	For sterilization and hemostasis
Adhesive slides	Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co.	188105	For tissue sectioning
Amobarbital	Sigma Aldrich (Shanghai) Trading Co.	A-020-1ML	For anesthesia in mice
Bluing Solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1866	Blue coloration of the nuclei of cells after the action of hematoxylin differentiation solution
C57BL/6 mice	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	(SCXK 2033-0063)	For use in animal experiments
Carbon steel surgical blades	Premier Medical Equipment Co.	SP239	For mouse surgery
CIKS/TRAF3IP2 Rabbit pAb	BIOSS ANTIBODIES	bs-6202R	Binds to Act1 in tissues
Cole's Hematoxylin Solution (For Conventional Stain)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1140	For staining paraffin sections
Collagen Type I Polyclonal antibody	proteintech	14695-1-AP	Binds to COL-1 in tissues
DAB Substrate kit,20x	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	DA1010	For tissue color development
Disposable surgical sheet 50*60CM	Nanchang Xuhui Medical Equipment Co.	SP4529777	For mouse surgery
EDTA decalcification solution (pH 7.2)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	E1171-500ml	For tissue decalcification
Enhanced Endogenous Peroxidase Bloching Buffer	Beyotime Biotechnology	P0100B	Sequestration of tissue or cellular endogenous peroxidases
Environmentally friendly dewaxing clear liquid	Servicebio	G1128-1L	For dewaxing paraffin sections
Ethyl Alcohol	CHRON CHEMICALS	64-17-5 (CAS)	For dehydration of paraffin sections
General Purpose Antibody Diluent	Epizyme Biotech	PS119L	For antibody dilution
Hematoxylin Differentiation Solution	Servicebio	G1039-500ML	For differentiation after hematoxylin staining and removal of excessively bound and non-specifically adsorbed dye from tissues
Hematoxylin Eosin (HE) Staining Kit	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1120-3*100ml	For tissue staining
High quality stainless steel surgical knife handle	Premier Medical Equipment Co.	SP0088	For mouse surgery
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	proteintech	SA00001-2	Binds to primary antibody and amplifies signal
IL-17A Polyclonal antibody	proteintech	13082-1-AP	Binds to IL-17 in tissues
IL-6 Polyclonal antibody	proteintech	21865-1-AP	Binds to IL-6 in tissues
Immunohistochemistry pen	Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co.	ZLI-9305 (YA0310)	For drawing circles in immunohistochemistry
Medical surgical suture Non-absorbent (ball) 5-0 3.5m	Yangzhou Yuanlikang Medical Equipment Co.	FHX-5-2	For postoperative suturing
Medical Suture Needles Angle Needles 4*10 3/8	Chaohu Binxiong Medical Equipment Co.	FHZ612-4	For postoperative suturing
Neutral Balsam	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G8590	As a slice sealer
PBS(1X)	Shenzhen Mohong Technology Co.,Ltd	B0015	Buffer for slide washing and partial solution dilution
Protein Free Rapid Blocking Buffer (1X)	Epizyme Biotech	PS108P	Avoiding non-specific binding of proteins
Rabbit Anti-Bone Alkaline Phosphatase antibody	BIOSS ANTIBODIES	bs-6292R	Binds to alkaline phosphatase in tissues
Saline	Affiliated Hospital Youjiang Medical University For Nationalities	LHN500	For animals by gavage
Shaving/Electric clippers	HANGZHOU HUAYUAN PET PRODUCTS CO., LTD.	DTJ-002	For shaving mice
Stainless Steel Medical Needle Holder 14cm Coarse Needle	Premier Medical Equipment Co.	SP784	For mouse surgery
Stainless Steel Ophthalmic Forceps 10.5cm Curved (No Hook)	Zhuoyouyue	YKNWW-10.5	For mouse surgery
Stainless Steel Ophthalmic Scissors/Surgical Scissors 10CM Straight Tip	Premier Medical Equipment Co.	ZYJD-10-ZJ	For mouse surgery
Stainless Steel Tip Gastric Needle 12 Gauge 55mm Elbow		GWJ-12-55W	For use in mice by gavage
Tris-EDTA Antigen Repair Fluid (50x)	proteintech	PR30002	For antigen repair of paraffin sections
Wooden dissecting board 25*16cm		JP16*24	For mouse surgery
Xiaoyao pills	Jiuzhitang Co.,Ltd.	YPG-041	For animal drug delivery
Others
R 4.3.1			Data processing
Cytoscape3.9.1	National Resource for Network Biology		Building a regulatory network for traditional Chinese medicine
ImageJ 1.54f	National Institutes of Health		Image processing for immunohistochemistry results
Adobe Photoshop 24.0.0	Adobe		For image combination
GraphpadPrism 9.5	GraphPad Software		Statistical analysis of data
cellsens Dimension	OLYMPUS		For slicing and photographing
OLYMPUS BX53	OLYMPUS		For HE staining and immunohistochemical section photography