Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר הפכה לבעיה עולמית של בריאות הציבור. מטרת מחקר זה היא לחקור את ההשפעות הטיפוליות ואת המנגנונים הקשורים של הרפואה הסינית המסורתית Xiaoyao גלולות על מצב זה.

Abstract

אוסטאופורוזיס היא מחלה מטבולית נפוצה בקרב נשים מבוגרות ולאחר גיל המעבר, ללא תסמינים ברורים בשלביה המוקדמים. בשלבים האחרונים של מצב זה, החולים נוטים לשברים, וזה יכול להשפיע ברצינות על בריאותם ואיכות חייהם. העלייה העולמית בתוחלת החיים הפכה את אוסטאופורוזיס לדאגה עולמית. גלולות Xiaoyao היו בעבר
משמש לטיפול בדיכאון. בנוסף, נראה כי התרופה הייתה בעלת פעילות דמוית אסטרוגן, אשר השפיעה על ביטוי ALP, סמן מוקדם ספציפי לאוסטאובלסטים, ו- COL-1, מרכיב עיקרי של מטריצה חוץ-תאית בעצמות. גלולות Xiaoyao הוערכו על השפעתן על אוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר (PMOM) בעכברים. מידע היעד של כל רכיב צמחי של גלולות Xiaoyao היה נגיש באמצעות מסד הנתונים של מערכות רפואה סינית מסורתית (TCMSP). מידע מ- GeneCards, OMIM, PharmGkb, TTD, DrugBank ואתרים אחרים שימש לבניית הרשת הרגולטורית של קומפלקס הצמחים באמצעות רשת Cytoscape ו- String כדי להעריך את אינטראקציות החלבון. עכברים עברו כריתת שחלות, וטופלו במינונים גבוהים ונמוכים של גלולות Xiaoyao ואלה הושוו לקבוצת הביקורת. הסימפטומים שלהם הוערכו על ידי אימונוציטוכימיה של רקמות העצם. התוצאות הצביעו על כך שלגלולות Xiaoyao הייתה היכולת להקל על הסימפטומים של PMOM בעכברות שעברו כריתת שחלות דרך מסלול האיתות IL-17. תרופה זו יש פוטנציאל להיות סוכן טיפולי חדשני לטיפול אוסטאופורוזיס.

Introduction

ארגון הבריאות העולמי (WHO) מגדיר אוסטאופורוזיס (OP) כמחלה המאופיינת בירידה במסת העצם ובהידרדרות המיקרוארכיטקטורה של רקמת העצם, מה שמוביל לעלייה בשבירות העצם, ובכך לסיכון מוגבר לשבר1. המשמעות הקלינית של אוסטאופורוזיס היא שהיא עלולה להוביל לשברים, הקשורים לתמותה גבוהה, לתחלואה ולעלויות כלכליותגבוהות 2. אוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר (PMOP) נגרמת על ידי ירידה ברמות האסטרוגן אצל נשים לאחר גיל המעבר, מה שמוביל לעלייה בפעילות אוסטאוקלסט, וכתוצאה מכך אובדן עצם והרס של מיקרו-מבנה העצם. זה גורם לעתים קרובות אוסטאופורוזיס עם השפעה חמורה על הבריאות3. הטיפולים הנוכחיים עבור PMOP כוללים טיפול בתחליפי אסטרוגן, ביספוספונטים והורמון יותרת התריס, אך הם יכולים להיות בדרגות שונות של תופעות לוואי, תאימות לא מספקת לטווח ארוך ועלויות גבוהות4. לכן, רפואת צמחים במחיר סביר היא חלופה קיימא עבור חלק גדול של האוכלוסייה.

גלולות Xiaoyao כלולות בפרמקופיאההסינית 5, והן מכילות שמונה רכיבים צמחיים, כולל Chai Hu, Angelica sinensis, White paeonia lactiflora, Atractylodes macrocephala, Poria cocos, Menthae Herba, ליקוריץ וג'ינג'ר טרי. כל צמחי המרפא הללו ידועים כיעילים בניקוי רעלים מהכבד ובחיזוק הטחול, הזנת הדם וויסות המחזור החודשי, והתערובת שימשה גם לטיפול בדיכאון6. עם זאת, תפקידן של גלולות Xiaoyao באוסטאופורוזיס אינו ברור.

מחקרים מוקדמים הראו כי דלקת יכולה להוביל לאובדן עצם7, וכי הירידה בצפיפות העצם הקשורה לתהליך זה עשויה להיות מואצת על ידי גיל המעבר. בנוסף, קיים קשר חזק בין התפתחות אוסטאופורוזיס ודלקת. הגורם הדלקתי, אינטרלוקין-17 (IL-17), הוא גורם פרו-דלקתי המופרש על ידי תאי Th17, תת-קבוצה של לימפוציטים מסוג CD4+ T. תאים אלה קשורים למספר מצבים דלקתיים כרוניים, והם ממלאים תפקיד חשוב בהתפתחות הרס העצם בדלקת מפרקים שגרונית8. בנוסף, IL-17 מעורר מפעיל קולטן ליגנד גרעיני-κ B (RANKL), המווסת אוסטאוקלסטוטגנזה, מה שמוביל לספיגת עצם גדולה יותר מאשר היווצרותעצם 9. IL-17 מעורר ביטוי של ציטוקינים אוסטאוקלסטוגניים אחרים כגון TNFα, IL-1, IL-6 ו- IL-8. יש לו את היכולת סינרגיה עם גורמים דלקתיים אחרים, מה שהופך אותו אפקט דלקתי חשוב10.

מחקרים הראו גם קשר בין גלולות Xiaoyao לבין דלקת. Shi et al.11 ו- Fang et al.12 אישרו לאחרונה כי גלולות Xiaoyao יכולות להפחית את רמות IL-6 ו- TNF-α, בהתאמה. במחקר אחר של סטאטוהפטיטיס הקשור למטבוליזם, דווח כי גלולות Xiaoyao יכול לווסת את הביטוי של חומצה פרופיונית, אשר בתורו מעכב את הביטוי של TNF-α ומפעיל השפעה אנטי דלקתית13. עם זאת, נכון לעכשיו, לא ידוע אם גלולות Xiaoyao יכול לווסת את הפיתוח של PMOM על ידי תיווך תגובה דלקתית באמצעות IL-17, אשר היה המטרה של מחקר זה.

מחקר זה חזה את הצטלבות המטרות של גלולות Xiaoyao וגנים הקשורים לאוסטאופורוזיס באמצעות פרמקולוגיה ברשת וניתוח ביואינפורמטיקה וניתח את הגנים המצטלבים עבור אינטראקציות חלבונים, GO ו- KEGG. בהתבסס על התוצאות החזויות, ניתן לראות את הביטוי של Act1 ו- IL-6, שהם חלבוני מפתח במסלול האיתות IL-17,14,15, כמו גם את סמני תחלופת העצם phosphatase אלקליין (ALP) וקולגן מסוג I (COL-1), כדי לבחון את היעילות הטיפולית של גלולות Xiaoyao במודל עכברי PMOM.

Protocol

ועדת האתיקה של חיות מעבדה באוניברסיטה הרפואית ללאומים של יוג'יאנג אישרה את פרוטוקול המחקר (מספר אישור: 2022101502). נקבות עכברי C57BL/6, בגילאי 10-12 שבועות, בדרגת SPF ומשקל גוף (22 ± 2) גרם, שוכנו במרכז לניסויים בבעלי חיים מסוג SPF של האוניברסיטה הרפואית יוג'יאנג ללאומים. חיות הניסוי נשמרו בטמפרטורה של 24-26 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 55% עד 60%.

1. מערכות רפואה סינית מסורתית, בסיס נתונים פרמקולוגי ופלטפורמת ניתוח

הערה: מסד נתונים וניתוח פרמקולוגיה של מערכות רפואה סינית מסורתית (TCMSP; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) הן פלטפורמות פרמקולוגיה של רפואה סינית המכילות מידע על מרכיבי TCM, תכונות הקשורות ל- ADME, מטרות ומחלות16,17.

  1. גש לממשק האינטרנט של TCMSP. חפשו את שם הרב, הזינו את שם התרופה הסינית ולחצו על 'חפש'. לחץ על שם לטיני בתוצאות החיפוש. בצע סינון על תוצאות החומרים עם הפרמטרים OB ≥ 30% ו- DL ≥ 0.18.
  2. העתק את כל התוצאות ושמור אותן בפורמט TXT, בשם רפואה סינית Name_ingredients.txt.
  3. תחת מידע יעדים בכרטיסיה יעדים קשורים, סנן עבור מזהה מול (כלומר, התוצאה בשלב 1.2).
  4. העתק את התוצאות המסוננות ושמור אותן בפורמט TXT בשם רפואה סינית Name_targets.txt.
    הערה: באמצעות השלבים לעיל, כל החומרים הפעילים המתאימים ומידע היעד המתאים של הרפואה הסינית המסורתית (TCM) התקבלו.
  5. מקם את כל קבצי ingredients.txt וקבצי targets.txt לעיל באותה תיקייה ומקם את סקריפטי Perl (קובץ קידוד משלים 1) בתיקייה זו.
  6. פתח את CMD, הקלד את נתיב תיקיית התקליטור, הזן אותו והפעל את סקריפט Perl. קבל קובץ טקסט חדש (allTargets.txt). קובץ טקסט חדש זה (allTargets.txt) מכיל את שם הצמחים, שם הרכיב, מזהה הרכיב והיעד.

2. מסד נתונים UniProt

הערה: מסד הנתונים UniProt (https://www.uniprot.org/) מכיל רצפי חלבונים אנושיים עם הערות עם מידע פונקציונלי, והוא משמש לנרמול שמות המטרות לשמותיהם הרשמיים18.

  1. עבור אל ממשק האינטרנט של UniProt. לחץ על הכרטיסיה חיפוש , בחר UniProtKB ולחץ על חיפוש.
  2. סנן בסרגל הצד השמאלי, בחר Review (Swiss-Prot) עבור מצב ואדם עבור אורגניזמים פופולריים. לחץ על הורד, בחר הורד הכל, בחר TSV עבור פורמט ולחץ על הורד כדי להוריד את קובץ ההערה.
  3. חלץ את הקובץ שהורדת לתיקיה הנוכחית, פתח את הקובץ שלא רוכסן והעתק והדבק אותו בקובץ טקסט בשם ann.txt.

3. המרת מזהה יעד לתרופה

  1. הכנס את כל קבצי היעד לסמים שהושגו allTargets.txt בסעיף 1 ואת קובץ הביאור של UniProt ann.txt להשיג בסעיף 2 לתיקיה והכנס לתוכו את סקריפטי Perl (קובץ קידוד משלים 2).
  2. פתח את CMD, הקלד cd + space + folder path, הזן אותו והפעל את סקריפט Perl כדי לקבל קובץ טקסט חדש (allTargets.symbol.txt). קובץ טקסט חדש זה (allTargets.symbol.txt) מכיל את שם הצמחים, מזהה המרכיב, שם הרכיב ומזהה הגן.

4. חיפוש במסד נתונים

  1. GeneCards: מסד נתונים של גנים אנושיים (GeneCards)
    הערה: מסד הנתונים GeneCards (https://www.genecards.org/) מספק מידע חיזוי וביאור עבור גנים אנושיים. הוא משמש כדי לגשת ליעדי מחלה19,20.
    1. עבור אל ממשק האינטרנט GeneCards. הקלד אוסטאופורוזיס בתיבת החיפוש ולחץ על חיפוש.
    2. לחץ על יצא ובחר יצא ל- Excel.
    3. פתח את הקובץ שהורדת, העתק את הגנים עם ציון רלוונטיות ≥ 1, והדבק ושמור אותם בקובץ בשם GeneCards.txt.
  2. מסד נתונים OMIM
    הערה: מאגר OMIM (https://omim.org) מכיל גנים אנושיים, מחלות גנטיות ותכונות21.
    1. עבור אל ממשק האינטרנט של OMIM. לחץ על מפת גנים, הקלד אוסטאופורוזיס בתיבת החיפוש ולחץ על חיפוש.
    2. לחץ על הורד בשם ובחר קובץ Excel.
    3. פתח את הקובץ שהורדת, העתק את שם הגן בעמודה סמל מאושר, הדבק אותו ושמור אותו בקובץ בשם OMIM.txt.
  3. מסד הנתונים PharmGkb
    הערה: PharmGkb (https://www.pharmgkb.org), מאגר הידע הפרמקוגנומי, מכיל ביאורים על תוויות תרופות, מסלולים ממוקדי-תרופות, סיכומים פרמקוגנטיים וקשרים בין גנים, תרופות ומחלות22.
    1. עבור אל ממשק האתר של PharmGkb. הזן אוסטאופורוזיס בתיבת החיפוש, לחץ על חיפוש ובדוק את הגן בסרגל הצד הימני.
    2. הזן את כל התוצאות באופן ידני ושמור אותן בקובץ בשם PharmGkb.txt.
  4. TTD: מסד נתונים של יעד טיפולי (TTD)
    הערה: מסד הנתונים TTD (https://idrblab.org/ttd/) מספק מידע על מטרות חלבונים וחומצות גרעין, מחלות ממוקדות, מידע על מסלולים ותרופות מתאימות עבור כל יעד23.
    1. עבור אל ממשק האינטרנט TTD. הקלד אוסטאופורוזיס בתיבת החיפוש ולחץ על חיפוש.
    2. לחץ על פרטי יעד תחת מזהה יעד בתוצאה, העתק את שם היעד, הדבק אותו ושמור אותו בקובץ בשם TTD.txt. סה"כ התקבלו 33 תוצאות. שמור כל תוצאה באותו אופן.
  5. מסד הנתונים של DrugBank Online (DrugBank)
    הערה: מסד הנתונים של DrugBank (https://go.drugbank.com) מכיל מידע על תרופות ומטרות לתרופות, אינטראקציות בין תרופתיות, מנגנוני תרופות ומטבוליזם של תרופות24.
    1. עבור אל ממשק אתר האינטרנט של DrugBank. בחר אינדיקציות בכרטיסיה חיפוש, הקלד אוסטאופורוזיס בתיבת החיפוש ולחץ על חיפוש.
    2. לחץ על הערך אוסטאופורוזיס בתוצאות לקבלת מידע נוסף, לחץ על הכרטיסייה תרופות ומטרות , ולחץ על הקישור המתאים בעמודה TARGET של הטבלה.
    3. לחץ על פרטים בחלבון, העתק את שם הגן, הדבק אותו ושמור אותו בקובץ בשם DrugBank.txt. שמור כל תוצאה באותו אופן.

5. דיאגרמת חיתוך קבוצות (Venn)

  1. מיזוג גנים הקשורים למחלות ומיפוי Venn
    1. מקם את קבצי txt שנשמרו כמו גם את הסקריפט באותה תיקייה.
    2. פתח את קוד R (מיזוג גנים הקשורים למחלות), העתק והדבק את הנתיב שבו מאוחסן קובץ txt לעיל בשורה שבה ממוקם setwd בקוד R.
    3. פתח את תוכנת R, הפעל את קוד R שהשתנה ושמור. הגדר את הגן, תן שם לקובץ Disease.txt.
    4. פתח את אתר האינטרנט של דיאגרמת חיתוך קבוצות (Venn) של Drawing; במקטע הקלט, העתק והדבק את תוכן הטקסט שנשמר במקטעים 4 עד 8 בזה אחר זה ברשימה, תן לו שם עם מסד הנתונים המתאים ולחץ על שלח.
    5. לחץ על Save Image As PNG מתחת לתמונה ושמור את תוצאת הטקסט באותה תיקייה.
  2. הצטלבות של מטרות תרופתיות וגנים הקשורים למחלות
    1. מקם את קובץ allTargets.symbol.txt שהתקבל בסעיף 3 ואת הקובץ Disease.txt שהתקבל בשלב 5.1.3 באותה תיקיה.
    2. פתח את קוד R (יעד תרופה וגן הקשור למחלה לוקחים הצטלבות), העתק והדבק את הנתיב שבו מאוחסן קובץ txt לעיל לשורה שבה setwd ממוקם בקוד R.
    3. פתח את תוכנת R, הפעל את קוד R שהשתנה ושמור. הגדר את הגן, תן שם לקובץ Drug_Disease.txt.
    4. פתח את אתר האינטרנט של דיאגרמת חיתוך קבוצות (Venn) של Drawing. במקטע הקלט, העתק והדבק allTargets.symbol.txt Disease.txt לרשימה ותן להם את השם על שם הקבצים המתאימים.
    5. לחץ על Save Image As PNG מתחת לתמונה, ושמור את תוצאות הטקסט באותה תיקייה.

6. בניית רשת רגולטורית של תרכובות TCM

  1. מקם את קובץ allTargets.symbol.txt שהתקבל בסעיף 3 באותה תיקייה שבה נמצא קובץ Disease.txt וסקריפט Perl המתאים (קובץ קידוד משלים 3).
  2. פתח את CMD, הקלד את נתיב קובץ התקליטור, הקש Enter והפעל את קובץ ה- Script של Perl. קבל ארבעה קבצי txt חדשים: net.geneLists.txt, net.molLists.txt, net.network.txt ו- net.type.txt. קובץ network.txt מכיל את מזהה הרכיב TCM, גן היעד, קשר היעד ושם הרכיב. net.type.txt מכיל שם צומת, תכונות ושיוך. net.geneLists.txt היא רשימת הגנים, ו net.molLists.txt היא רשימת המרכיבים.
  3. העתק את קבצי הטקסט החדשים שהתקבלו באותה תיקיה חדשה.
  4. פתח את תוכנת Cytoscape 3.9.1, לחץ על קובץ, לחץ על ייבוא ובחר קובץ טופס רשת. בחר net.network.txt, מקם את העמודה הראשונה של מזהה רכיב כצומת מקור, את העמודה השנייה של גנים כצומת יעד ואת העמודה השלישית של קשרי יעד כסוג אינטראקציה ולחץ על אישור.
  5. ייבוא net.type.txt מחלון טבלת הצומתים. לחץ על הכרטיסיה בחירה, בחר צמתים, בחר מקובץ רשימת מזהים, בחר net.geneLists.txt ולחץ על פתח.
  6. לחץ על הכרטיסיה פריסה, בחר פריסת עיגול ממוינת במידה ובחר צמתים נבחרים בלבד. התאם את הגובה והרוחב של הצמתים ל- 70.
  7. לחץ על התיבה השניה בגובה, בחר degree.layout בעמודה, בחר מיפוי רציף בסוג מיפוי ולחץ פעמיים על החלון התאמת גובה בצד ימין של מיפוי נוכחי כדי להתאים את הגבול העליון והתחתון של הגובה לטווח מתאים.
  8. חזור על הפעולה באמצעות האפשרות רוחב.
  9. לחץ שוב על הכרטיסיה פריסה ולחץ על כלי פריסה > התאם את קנה המידה כך שהצמתים לא יהיו חופפים.
  10. לחץ על החלון הימני העליון של התוכנה כדי להפוך את רשת הצמתים ללא מסומנת, לחץ על הכרטיסיה בחירה , בחר צמתים, בחר מקובץ רשימת מזהים, בחר net.molLists.txt ולחץ על פתח.
  11. לחץ על הכרטיסיה פריסה, בחר פריסת תכונות קבוצה, בחר צמתים שנבחרו בלבד ולחץ על סוג.
  12. לחץ על Label Font Size בעמודה הימנית והגדר את ערך ברירת המחדל ל- 12. לחץ על ערך ברירת מחדל בתמונה/תרשים 1 בעמודה הימנית.
  13. בחר תרשימים בחלון המוקפץ, לחץ על תרשים עוגה ובחר את הפריטים בעמודה עמודות זמינות למעט תואר. פריסה בעמודת העמודות שנבחרו ולחץ על החל.
  14. לחץ על צבע גבול בעמודה השמאלית והגדר את ערך ברירת המחדל ל- #003EF8. לחצו על הכרטיסייה Edge בתחתית סרגל הצד השמאלי וקבעו את הרוחב ל-0.8.
  15. לחץ/י על ״קובץ״ בסרגל הכלים העליון, בחר /י ״יצא״ ולאחר מכן בחר /י ״רשת לתמונה״.
  16. בחלון הקופץ, בחר תבנית PNG עבור פורמט, בחר את ספריית השמירה ותן שם לרשת התמונות, התאם את גודל התצוגה של התמונה ל- 500% המרבי, בחר רקע שקוף ולחץ על אישור כדי לסיים את שמירת התמונה.

7. מבנים של רשתות אינטראקציה חלבון-חלבון (PPI)

  1. פתח את אתר האינטרנט של STRING (https://string-db.org/), לחץ על Multiple Protein, לחץ על Browse in Upload a file, בחר את קובץ Drug_Disease.txt שהתקבל בשלב 5.2.3 ובחר Homo sapiens in Organisms. לחץ על חיפוש ולחץ על המשך.
  2. לחץ על הגדרות, הגדר את ציון האינטראקציה המינימלי הנדרש לביטחון הגבוה ביותר (0.900) וסמן את הסתר צמתים מנותקים ברשת באפשרויות התצוגה של הרשת. לחץ על עדכן.
  3. בצע התאמות בצמתים בדיאגרמת הרשת כך שלא תהיה חפיפה או חסימה.
  4. לחץ על ייצוא ולחץ על הורד כמפת סיביות ברזולוציה גבוהה כדי לקבל את מפת הרשת של עבודת החלבונים בתבנית PNG. כמו כן, הורד את קובץ TSV כפלט טקסט טבלאי קצר. שמור את שני הקבצים בתיקיה מאוחדת. קובץ TSV מכיל שם גן, מזהה פנימי של STRING וציונים עבור תכונות שונות.

8. בניית ליבת רשת PPI

  1. מקם את קובץ ה- TSV המתקבל בסעיף 7 ואת סקריפטי Perl הנדרשים בתיקיה חדשה.
  2. פתח את תוכנת Cytoscape 3.9.1, לחץ על קובץ, בחר ייבוא, לחץ על רשת מקובץ, בחר את קובץ TSV לעיל, מקם את צומת העמודה הראשונה1 כצומת מקור ואת צומת העמודה השני2 כצומת יעד ולחץ על אישור.
  3. לחץ/י על ״סגנון ״ בסרגל הצד הימני, לחץ/י על ״ערך ברירת מחדל ברוחב״ והגדר/י אותו ל- 60. גרור ושחרר את הצמתים כך שאין חפיפה ואין חסימה ברשת.
  4. לחץ על APPs בסרגל הכלים העליון, לחץ על CytoNCA ולחץ על פתח.
  5. בעמודה הימנית, בחר ללא משקל תחת בין, קרבה, מעלות, Eigenvector, שיטה מבוססת קישוריות ממוצעת מקומית ורשת, ולחץ על נתח.
  6. לאחר השלמת הניתוח, לחץ על טבלת צומת בחלון הימני התחתון, לחץ על ייצוא, שמור אותו בתיקיה ותן לו ציון 1.
    הערה: יש להתקין את תוסף CytoNCA בתוכנת Cytoscape. לשם כך, לחץ על יישומים בסרגל הכלים העליון, לחץ על מנהל היישומים, הזן CytoNCA בתיבת החיפוש, סמן את CytoNCA בעמודה האמצעית של התוצאות שהוחזרו ולחץ על התקן.
  7. פתח ניקוד1, התאם את עמודת השם לעמודה הראשונה, העתק את המידע בטבלה, הדבק אותו בקובץ טקסט חדש, תן לו שם score1.txt ושמור אותו.
  8. פתח את קוד R והעתק והדבק את הנתיב שבו ממוקם קובץ score1.txt לשורה שבה ממוקם ה- setwd בקוד R.
  9. פתח את תוכנת R והפעל את הקוד שהשתנה כדי לקבל שני קבצים חדשים, score2.txt ו- score2.gene.txt. קובץ score2.txt מכיל את הגנים שעבורם כל ציוני התוכנית היו גדולים מהחציון ואת הציונים הספציפיים עבור כל תוכנית. score2.gene.txt מכיל את הגנים שקיבלו ציון גבוה יותר מהחציון עבור כל הפריטים.
  10. כדי להמשיך ב- Cytoscape, לחץ על AnalysisPanel 1 בחלון הימני התחתון, לחץ על העלה מקובץ בצד שמאל של החלון, בחר את score2.gene.txt, לחץ על פתח והקש על אישור בחלון הקופץ.
  11. לחץ על Select Nodes בתחתית ולחץ על OK בחלון המוקפץ.
  12. לחץ על קובץ בסרגל הכלים העליון, בחר יצא, לחץ על רשת לתמונה, התאם את גודל התצוגה (%) בגודל תמונה ל- 500% המרבי, סמן את רקע שקוף ושמור את הקובץ באותה תיקיה, תן לו שם רשת1.
  13. לחץ על צור רשת משנה בסרגל הצד הימני של החלון התחתון כדי ליצור רשת משנה, נתח את רשת המשנה, לחץ על אפליקציות בסרגל הכלים בחלק העליון, לחץ על CytoNCA ולחץ על פתח.
  14. בסרגל הצד הימני, בחר/י ״ללא משקל ״ תחת ״בין״, ״קירבה״, ״מעלות״, ״אייגנווקטור״, ״שיטה מבוססת קישוריות ממוצעת מקומית״ ו״רשת״, ולחץ/י על ״נתח״.
  15. בסיום הניתוח, לחץ על טבלת צומת בחלון השמאלי התחתון, לחץ על יצא ושמור אותה בתיקיה חדשה בשם score2.
  16. פתח ניקוד2, התאם את עמודת השם לעמודה הראשונה, העתק את המידע בטבלה, הדבק אותו בקובץ טקסט חדש, תן לו שם score2.txt ושמור אותו.
  17. פתח את קוד R והעתק והדבק את הנתיב שבו ממוקם קובץ score2.txt לשורה שבה ממוקם ה- setwd בקוד R.
  18. פתח את תוכנת R והפעל את הקוד שהשתנה כדי לקבל שני קבצים חדשים: score3.txt ו- score3.gene.txt. קובץ score3.txt מכיל את הגנים שקיבלו ציון גבוה מהחציון עבור כל הפריטים ואת הציונים הספציפיים עבור כל פריט. score3.gene.txt מכיל את הגנים שקיבלו ציון גבוה יותר מהחציון עבור כל הפריטים.
  19. כדי להמשיך ב- Cytoscape, לחץ על AnalysisPanel 1 בחלון הימני התחתון, לחץ על העלה מקובץ בצד שמאל של החלון, בחר את score3.gene.txt, לחץ על פתח והקש על אישור בחלון המוקפץ.
  20. לחץ על Select Nodes בתחתית ולחץ על OK בחלון המוקפץ.
  21. לחץ על קובץ בסרגל הכלים העליון, בחר יצא, לחץ על רשת לתמונה, התאם את גודל התצוגה (%) בגודל תמונה ל- 500%, סמן את רקע שקוף ושמור את הקובץ באותה תיקיה שבה נעשה שימוש בשלב זה, תוך מתן שם לקובץ רשת2.
  22. לחץ/י על ״צור רשת משנה ״ בסרגל הצד השמאלי של החלון למטה כדי ליצור רשת משנה.
  23. לחץ על קובץ בסרגל הכלים בחלק העליון, בחר יצא, לחץ על רשת לתמונה, התאם את גודל התצוגה (%) בגודל תמונה למקסימום של 500%, סמן את רקע שקוף ושמור את הקובץ באותה תיקיה שבה נעשה שימוש בשלב זה ותן לו את השם רשת3.

9. המרת מזהה גן

  1. מקם את קובץ Drug_Disease.txt באותה תיקייה חדשה שבה נמצא קובץ הקוד הנדרש.
  2. פתח את קוד R (קובץ קידוד משלים 4) והעתק והדבק את הנתיב שבו ממוקם קובץ Drug_Disease.txt לשורה שבה ממוקם ה- setwd בקוד R.
  3. פתח את תוכנת R, הפעל את הקוד שהשתנה באמצעות הארגון. חבילה Hs.eg.db להמרת מזהה הגן והפעלה לאחר השלמת קובץ חדש id.txt. id.txt מכיל את סמל הגן ואת המזהה המתאים.

10. ניתוח העשרת GO

  1. מקם את קובץ id.txt מהשלב הקודם באותה תיקייה שבה נמצא קוד ניתוח ההעשרה של GO.
  2. פתח את קוד R (קובץ קידוד משלים 5) והגדר את ספריית העבודה ל- id.txt ואת הנתיב שבו מאוחסן קוד GO.
  3. פתח את תוכנת R, הפעל את הקוד שהשתנה והשתמש ב- clusterProfiler, org. Hs.eg.db, להעשיר את העלילה, העלילה ggplot2, היסטוגרמות ניתוח העשרה GO, ועלילות בועה. קבל שלושה קבצים חדשים, GO.txt, barplot.pdf ו- bubble.pdf, לאחר השלמת ההפעלה.
    הערה: GO.txt הוא קובץ תוצאות ההעשרה המכיל סיווג העשרה (BP, CC, MF), GO ID, GO NAME, פרופורציית גנים, יחס רקע, משמעות העשרה ערך p, ערך p מתוקן (p.adjust, value), מזהה גן (name) ומספר גנים מועשרים בכל GO. barplot.pdf היא ההיסטוגרמה, בועה. PDF הוא עלילת בועה.

11. ניתוח העשרה של KEGG

  1. מקם את קובץ id.txt באותה תיקייה שבה נמצא קוד ניתוח ההעשרה של KEGG.
  2. פתח את קוד R (קובץ קידוד משלים 6) והגדר את ספריית העבודה לנתיב שבו מאוחסנים קוד id.txt ו- KEGG.
  3. פתח את תוכנת R, הפעל את הקוד שהשתנה והשתמש ב- clusterProfiler, org. חבילת Hs.eg.db, enrichplot, ggplot2 להתוות היסטוגרמות ניתוח העשרה GO, חלקות בועות ועלילות מסלול. הריצה הושלמה עם הפקה של שלושה קבצים חדשים, KEGG.txt, barplot.pdf ו- bubble.pdf.
    הערה: קובץ KEGG.txt הוא קובץ תוצאות העשרה המכיל מזהה מסלול, תיאור מסלול, פרופורציית גנים, פרופורציית רקע, ערך p מובהק העשרה, ערך p מתוקן (p.adjust, qvalue), מזהה גן (שם) ומספר הגנים המועשרים בכל מסלול. barplot.pdf הוא תרשים עמודות ו- bubble.pdf הוא תרשים בועות.
  4. חפש IL-17 בקובץ KEGG.txt; התוצאה מראה שיש רק מסלול אחד; העתק את מזהה הנתיב.
  5. פתח את קוד R, הדבק את מזהה המסלול IL-17 ב- KEGGID והשתמש בחבילת תצוגת הנתיבים כדי לתייג את מפת הנתיב. הפעל את קוד R שהשתנה וקבל שני קבצים חדשים, hsa04657.pathview.png ו- hsa04657.png.
    הערה: קובץ hsa04657.png הוא מפת המסלולים, hsa04657.pathview.png הוא מפת המסלולים המסומנת בכותרת, ואלה המסומנים באדום הם הגנים הנמצאים ברשת האינטראקציות.

12. הכנת גלולות Xiaoyao

הערה: לשיטת ההכנה בה נעשה שימוש, עיין בפרמקופיאה סינית5.

  1. קח 100 גרם של Chai Hu, 100 גרם של Angelica sinensis, 100 גרם של לבן Paeonia lactiflora, 100 גרם של Atractylodes macrocephala מוקפץ, 100 גרם של פוריה קוקוס, 80 גרם של Radix glycyrrhizae preparate, ו 20 גרם של Menthae herba.
  2. באמצעות טחנת אבן או מכונת אבקה, למחוץ את עשבי תיבול לאבקה דקה; מספר עשבי תיבול משולבים בפרופורציות הנ"ל ומרוסקים לאבקה דקה כדי לערבב יחד באופן טבעי. השתמש מסננת סמים 80 רשת עם קוטר פנימי של 180 מיקרומטר ± 7.6 מיקרומטר ולסנן את האבקה כתוש. מערבבים היטב.
  3. קחו 100 גרם ג'ינג'ר, הוסיפו מים והרתיחו 2 פעמים במשך 20 דקות בכל פעם. מסננים ומניחים בצד.
  4. קחו פלאק רפואי, טבלו מטאטא קטן במי ג'ינג'ר, הברישו אותו על הלוח, קחו את האבקה הנ"ל, פזרו אותה על מי הג'ינג'ר, והפכו את הפלאק כך שכל האבקה תהיה רטובה וניתן יהיה לעצב אותה לצורת כדור.
    הערה: היווצרות הרובד הרפואי היא צעד חיוני במהלך הכנת גלולות TCM. רוב במבוק המוסו יפוצל לרצועות וייארג לשלד. עור הבמבוק, או טנגפי, ארוג על פני השטח, והוא נעשה מעוגל. פני השטח של הלוח צריך להיות מצופה דק עם שמן טונג ולאחר מכן מוברש עם שכבה של לכה. זה מיובש כדי להיות אטום למים. הגלולות המיוצרות באופן זה יהיו עגולות וחלקות.
  5. מברישים שוב על מי הג'ינג'ר, מפזרים את האבקה ומסובבים את הרובד כך שהתרופה מעוגלת בהדרגה ומוגדלת. מניחים במקום קריר לייבוש.

13. ביסוס מודל בעלי החיים

  1. לאחר 7 ימי התאקלמות, חלקו באופן אקראי את עכברי הניסוי ל-4 קבוצות, כלומר, קבוצת ניתוח הדמה (Sham, שם הוסר רק השומן סביב השחלות) ושלוש קבוצות של עכברות שעברו כריתת שחלות המורכבות מקבוצת מודל (OVX) וכן קבוצות מתן גלולות Xiaoyao בריכוז נמוך וגבוה.
  2. מרדימים את העכברים עם 3% נתרן pentobarbital (40 מ"ג / ק"ג) מוזרק intraperitoneally. בדקו שהעכברים נכנסים למצב הרדמה על ידי התבוננות בהרפיית שרירים כללית, נשימה עמוקה ואיטית והאטה בתנועה. יש למרוח משחת עיניים על עיני העכברים לפני הניתוח.
  3. מניחים את בעלי החיים במצב נוטה ומגלחים את אזור הכליות של הגב עם מכונת גילוח לבעלי חיים. בצע חיטוי מקומי עם אתנול 75%.
  4. בצע חתך אורכי של כ 1 ס"מ דו צדדי, קרוב לאזור הגבי של הכליה, וחתך את הפאשיה כדי להפריד את השרירים ואת הצפק.
  5. אתר את החלק העליון של קרן הרחם ואת החצוצרות לקשירה. החדרת מלקחיים לחתך לצורך חקירה, ואיתור השחלה, עטופה ברקמת שומן בתבנית כרובית אדומה בוהקת, עם חצוצרות מסודרות ספירלית מתחת לשחלה, המחברות את השחלה לקרן הרחם25. הסר את השחלות עם מספריים כירורגיים ותפר.
  6. הסר כמות קטנה של רקמת שומן ליד השחלה כביקורת בקבוצת ניתוח דמה. התבוננו בבעלי חיים עד שהם חוזרים להכרה. הניחו את בעלי החיים לאחר הניתוח בכלובים נפרדים עד להחלמה מלאה.
  7. כדי למנוע זיהום, לספק עכברים עם gentamicin במשך 3 ימים לאחר הניתוח. לאחר הניתוח יש להקפיד על תזונה תקינה וסביבת גדילה טובה בהתאם למצבם האמיתי של העכברים. אם יש חריגות, כגון זיהום בפצע או אובדן תיאבון, יש להתייעץ מיד עם המדריך של מרכז חיות המעבדה.

14. מתן תרופות

הערה: על פי מתודולוגיית ניסוי פרמקולוגיה26, ההמרה של מינונים בני אדם ובעלי חיים בשימוש היה 9 גרם של גלולות Xiaoyao עבור מבוגר 70 ק"ג, שווה ערך למנה אחת (מינון עבור מתן יחיד).

  1. עבור קבוצות המינון הנמוך והגבוה, יש להשתמש ב-0.683 גרם/ק"ג ו-2.73 גרם/ק"ג, בהתאמה, עבור קבוצה של 8 בעלי חיים. השתמש ביד שמאל כדי לשתק את העכבר כך שפיו של העכבר יהיה בקו ישר עם הוושט. מחזיק את מחט gavage ביד ימין, בעדינות להכניס אותו לתוך הוושט לאורך הקיר האחורי של הלוע מזווית הפה של העכבר.
  2. בשלב זה, ניתן לשנות מעט את כיוון מחט ה- gavage כדי לעורר פעולת בליעה מושרית. להזריק את התרופה. בצע זאת פעם ביום במשך 12 שבועות.
  3. עבור קבוצות המופעלות על ידי דמה ודוגמניות, יש לתת מי מלח פעם ביום במשך 12 שבועות בכמות שנקבעת לפי משקל החיה.
  4. הרדימו עכברים על ידי פריקת צוואר הרחם וחתכו את גפיהם האחוריות. עור את הגפיים כדי להפריד את השריר מן עצם הירך. יש לטפל בעצם הירך של עכברים בתמיסת הסתיידות EDTA למשך חודש אחד ולהחליף בתמיסה טרייה מדי יום.

15. צביעת Hematoxylin-eosin (HE) צביעה

  1. Dewax רקמות הירך במשך 8 דקות ולאחר מכן מניחים אתנול הדרגתי במשך 3 דקות; יש לשטוף במים זורמים במשך דקה אחת.
  2. מוסיפים תמיסת צביעת המטוקסילין טיפה לחלקים כדי לכסות לחלוטין את הרקמה, מכתימים למשך 5 דקות ושוטפים במי ברז
  3. הוסף את תמיסת התמיינות החומצה ההידרוכלורית לרקמה בשקופית, וודא שהיא מכסה לחלוטין את הרקמה. עצור כאשר שינוי צבע של הרקמה הוא ציין. יש לשטוף במי ברז.
  4. מוסיפים תמיסת צבע Eosin טיפה ולאפשר לכסות את הרקמה לחלוטין, משחק במשך 30 s עד 2 דקות. שטפו את עודפי הצבע במים זורמים.
  5. יש לבצע התייבשות אתנול הדרגתית עם אתנול נטול מים 75% למשך 5 דקות, לאחר מכן אתנול נטול מים למשך 5 דקות, ולנקות באמצעות תמיסת שעווה למשך 3 דקות.
  6. יש לזרוק כמות מתאימה של חניכיים ניטרליות על המגלשה בהתאם לגודל הרקמה, ולהוריד את הכיסוי בזהירות, תוך הימנעות מבועות אוויר.

16. ניתוח מיקרו-CT ואימונוהיסטוכימיה

  1. הסר עודפי שרירים ורצועות סביב דגימות עצם הירך מקבוצות עכברים שונות וקבע את רקמות הדגימה בפרפורמלדהיד 4% למשך 24 שעות.
  2. ייבוש רקמות עצם באוויר וביצוע מיקרו-CT על ידי סריקת רקמת עצם על מנת לקבל נתוני מיקרו-CT תלת מימדיים.
  3. מגושי שעווה עכבר משומרים, חותכים אותם לחלקים רציפים בעובי 6 מיקרומטר ואופים את הפרוסות ב 70 ° C -72 ° C במשך 30-60 דקות.
  4. Dewax במשך 8 דקות, ולאחר מכן טיפול אתנול 75% נטול מים במשך 5 דקות, אתנול נטול מים במשך 5 דקות, ו PBS לשטוף במשך 5 דקות במשך 3x.
  5. בצע תיקון בלחץ גבוה EDTA למשך 15 דקות ולאחר מכן שטיפת PBS למשך 5 דקות למשך 3x.
  6. הוסיפו 3% מי חמצן טיפתיים לרקמה, דגרו בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, ושטפו עם PBS במשך 5 דקות במשך 3x.
  7. השתמש בעט אימונוהיסטוכימיה כדי לצייר עיגול. יש לשטוף עם שטיפת PBS במשך 3 דקות למשך 3 דקות.
  8. כתם בנוגדן ראשוני (pAb ארנב אנטי-ALP (1:200), pAb ארנב אנטי-COL-1 (1:200), pAb ארנב אנטי-IL-17 (1:275), אנטי-Act1 (1:500), pAb ארנב אנטי-IL-6 (1:500)) למשך הלילה, ולאחר מכן שטיפת חיץ PBS למשך 5 דקות במשך 3x.
  9. יש להוסיף את הנוגדן המשני (HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L; 1:2000)) ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות. יש לשטוף עם מאגר PBS למשך 3 דקות למשך 3 דקות.
  10. יש לדגור ב-DAB מוכן לשימוש למשך 3-5 דקות, ולאחר מכן לשטוף עם PBS.
  11. יש לבצע צביעה מחדש של המטוקסילין למשך 3 דקות, ולאחר מכן לשטוף PBS.
  12. יש להשתמש בתמיסת בידול למשך כ-10 שניות, ולאחר מכן לשטוף PBS.
  13. הוסף תמיסה כחולה חוזרת למשך 10 שניות, ולאחר מכן שטיפת PBS.
  14. בצע טיפול אתנול 75% נטול מים במשך 5 דקות, אתנול נטול מים במשך 5 דקות, וברור במשך 3 דקות. השתמשו בשרף נייטרלי לאיטום שקופיות.

תוצאות

חומרים פעילים ומטרות פעולה של גלולות Xiaoyao
על ידי חיפוש במסד הנתונים של TCMSP וסינון על פי הקריטריונים של זמינות ביולוגית אוראלית (OB) ≥ 30% ותכונות דמויות תרופות (DL) ≥ 0.18, נמצאו 125 חומרים פעילים קיימים בגלולות Xiaoyao. ביניהם, מרכיבים 6, 4, 9, 13, 2, 6, 83 ו -2 היו מ Paeonia lactiflora לבן, Atractylodes macroceph...

Discussion

על פי הסטטיסטיקה, אוסטאופורוזיס גורם 1.5 מיליון שברים מדי שנה בארצות הברית, ואת רובם המכריע להתרחש אצל נשים לאחר גיל המעבר27. עם הגידול באוכלוסייה המזדקנת, צפוי כי רוב שברי הירך העתידיים בעולם יתרחשו באסיה וכי עד שנת 2050, המספר הכולל של אלה ברחבי העולם יגיע ל -8.2 מיליון28

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

Acknowledgements

תוכנית המחקר המדעי ופיתוח הטכנולוגיה של Baise City (20224128) תמכה בעבודה זו. המחברים מודים לד"ר דב סוראנה מאימפריאל קולג' בלונדון ומ-YMUN על עריכת כתב היד. YYX ו-ZYW תרמו באופן שווה למחקר זה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1ml SamplerGuangxi Beilunhe Medical Industrial Group Co.JYQ001For anesthesia in mice
4%polyformaldehydeBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.P1110For tissue fixation
6-0 absorbable suture (angled needle)Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co.HZX-06For postoperative suturing
Absorbent cotton ballWinnerMIANQIU-500gFor sterilization and hemostasis
Adhesive slidesJiangsu Shitai Experimental Equipment Co.188105For tissue sectioning
AmobarbitalSigma Aldrich (Shanghai) Trading Co.A-020-1MLFor anesthesia in mice
Bluing SolutionBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.G1866Blue coloration of the nuclei of cells after the action of hematoxylin differentiation solution
C57BL/6 miceBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.(SCXK 2033-0063)For use in animal experiments
Carbon steel surgical bladesPremier Medical Equipment Co.SP239For mouse surgery
CIKS/TRAF3IP2 Rabbit pAbBIOSS ANTIBODIESbs-6202RBinds to Act1 in tissues
Cole's Hematoxylin Solution (For Conventional Stain)Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.G1140For staining paraffin sections
Collagen Type I Polyclonal antibodyproteintech14695-1-APBinds to COL-1 in tissues
DAB Substrate kit,20xBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.DA1010For tissue color development
Disposable surgical sheet 50*60CMNanchang Xuhui Medical Equipment Co.SP4529777For mouse surgery
EDTA decalcification solution (pH 7.2)Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.E1171-500mlFor tissue decalcification
Enhanced Endogenous Peroxidase Bloching BufferBeyotime BiotechnologyP0100BSequestration of tissue or cellular endogenous peroxidases
Environmentally friendly dewaxing clear liquidServicebioG1128-1LFor dewaxing paraffin sections
Ethyl AlcoholCHRON CHEMICALS64-17-5 (CAS)For dehydration of paraffin sections
General Purpose Antibody DiluentEpizyme BiotechPS119LFor antibody dilution
Hematoxylin Differentiation SolutionServicebioG1039-500MLFor differentiation after hematoxylin staining and removal of excessively bound and non-specifically adsorbed dye from tissues
Hematoxylin Eosin (HE) Staining KitBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.G1120-3*100mlFor tissue staining
High quality stainless steel surgical knife handlePremier Medical Equipment Co.SP0088For mouse surgery
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)proteintechSA00001-2Binds to primary antibody and amplifies signal
IL-17A Polyclonal antibodyproteintech13082-1-APBinds to IL-17 in tissues
IL-6 Polyclonal antibodyproteintech21865-1-APBinds to IL-6 in tissues
Immunohistochemistry penBeijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co.ZLI-9305 (YA0310)For drawing circles in immunohistochemistry
Medical surgical suture Non-absorbent (ball) 5-0 3.5mYangzhou Yuanlikang Medical Equipment Co.FHX-5-2For postoperative suturing
Medical Suture Needles Angle Needles 4*10 3/8Chaohu Binxiong Medical Equipment Co.FHZ612-4For postoperative suturing
Neutral BalsamBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.G8590As a slice sealer
PBS(1X)Shenzhen Mohong Technology Co.,LtdB0015Buffer for slide washing and partial solution dilution
Protein Free Rapid Blocking Buffer (1X)Epizyme BiotechPS108PAvoiding non-specific binding of proteins
Rabbit Anti-Bone Alkaline Phosphatase antibodyBIOSS ANTIBODIESbs-6292RBinds to alkaline phosphatase in tissues
SalineAffiliated Hospital Youjiang Medical University For NationalitiesLHN500For animals by gavage
Shaving/Electric clippersHANGZHOU HUAYUAN PET PRODUCTS CO., LTD.DTJ-002For shaving mice
Stainless Steel Medical Needle Holder 14cm Coarse NeedlePremier Medical Equipment Co.SP784For mouse surgery
Stainless Steel Ophthalmic Forceps 10.5cm Curved (No Hook)ZhuoyouyueYKNWW-10.5For mouse surgery
Stainless Steel Ophthalmic Scissors/Surgical Scissors 10CM Straight TipPremier Medical Equipment Co.ZYJD-10-ZJFor mouse surgery
Stainless Steel Tip Gastric Needle 12 Gauge 55mm ElbowGWJ-12-55WFor use in mice by gavage
Tris-EDTA Antigen Repair Fluid (50x)proteintechPR30002For antigen repair of paraffin sections
Wooden dissecting board 25*16cmJP16*24For mouse surgery
Xiaoyao pillsJiuzhitang Co.,Ltd.YPG-041For animal drug delivery
Others
R 4.3.1Data processing
Cytoscape3.9.1National Resource for Network BiologyBuilding a regulatory network for traditional Chinese medicine
ImageJ 1.54fNational Institutes of HealthImage processing for immunohistochemistry results
Adobe Photoshop 24.0.0AdobeFor image combination
GraphpadPrism 9.5GraphPad SoftwareStatistical analysis of data
cellsens DimensionOLYMPUSFor slicing and photographing
OLYMPUS BX53OLYMPUSFor HE staining and immunohistochemical section photography

References

  1. Kanis, J. A., Melton, L. J., Christiansen, C., Johnston, C. C., Khaltaev, N. The diagnosis of osteoporosis. J Bone Miner Res. 9 (8), 1137-1141 (1994).
  2. Amin, U., Mcpartland, A., O'sullivan, M., Silke, C. An overview of the management of osteoporosis in the aging female population. Womens Health (Lond). 19, 17455057231176655 (2023).
  3. Słupski, W., Jawień, P., Nowak, B. Botanicals in postmenopausal osteoporosis. Nutrients. 13 (5), 1609 (2021).
  4. Sharma, A., et al. Understanding the mechanistic potential of plant based phytochemicals in management of postmenopausal osteoporosis. Biomed Pharmacother. 163, 114850 (2023).
  5. . Pharmacopoeia of people's republic of china. Chinese Pharmacopeia Commission. , (2020).
  6. Ji, Y., et al. Xiaoyao pills ameliorate depression-like behaviors and oxidative stress induced by olfactory bulbectomy in rats via the activation of the pik3ca-akt1-nfe2l2/bdnf signaling pathway. Front Pharmacol. 12, 643456 (2021).
  7. Lencel, P., Magne, D. Inflammaging: The driving force in osteoporosis. Med Hypotheses. 76 (3), 317-321 (2011).
  8. Daoussis, D., Andonopoulos, A. P., Liossis, S. N. Wnt pathway and il-17: Novel regulators of joint remodeling in rheumatic diseases. Looking beyond the rank-rankl-opg axis. Semin Arthritis Rheum. 39 (5), 369-383 (2010).
  9. Amarasekara, D. S., et al. Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks. Immune Netw. 18 (1), e8 (2018).
  10. Amatya, N., Garg, A. V., Gaffen, S. L. Il-17 signaling: The yin and the yang. Trends Immunol. 38 (5), 310-322 (2017).
  11. Shi, B., et al. Xiaoyao pills prevent lipopolysaccharide-induced depression by inhibiting inflammation and protecting nerves. Front Pharmacol. 10, 1324 (2019).
  12. Fang, Y., et al. Xiaoyao pills attenuate inflammation and nerve injury induced by lipopolysaccharide in hippocampal neurons in vitro. Neural Plast. 2020, 8841332 (2020).
  13. Zhang, X., et al. Effect of xiaoyao pills on fecal endogenous metabolites in rats with metabolism-associated steatohepatitis. J Shanxi Med University. 55, 36-43 (2024).
  14. Xiao, J., et al. Il-17 in osteoarthritis: A narrative review. Open Life Sci. 18 (1), 20220747 (2023).
  15. Mcgeachy, M. J., Cua, D. J., Gaffen, S. L. The il-17 family of cytokines in health and disease. Immunity. 50 (4), 892-906 (2019).
  16. Ru, J., et al. Tcmsp: A database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines. J Cheminform. 6, 13 (2014).
  17. Wang, T., et al. Exploring the mechanism of luteolin by regulating microglia polarization based on network pharmacology and in vitro experiments. Sci Rep. 13 (1), 13767 (2023).
  18. UniProt Consortium. UniProt: The universal protein knowledgebase in 2023. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D523-D531 (2023).
  19. Barshir, R., et al. Genecarna: A comprehensive gene-centric database of human non-coding rnas in the genecards suite. J Mol Biol. 433 (11), 166913 (2021).
  20. Wang, T., Jiang, X., Lu, Y., Ruan, Y., Wang, J. Identification and integration analysis of a novel prognostic signature associated with cuproptosis-related ferroptosis genes and relevant lncrna regulatory axis in lung adenocarcinoma. Aging (Albany NY). 15 (5), 1543-1563 (2023).
  21. Amberger, J. S., Bocchini, C. A., Scott, A. F., Hamosh, A. Omim.Org: Leveraging knowledge across phenotype-gene relationships. Nuc Acid Res. 47 (D1), D1038-D1043 (2019).
  22. Whirl-Carrillo, M., et al. An evidence-based framework for evaluating pharmacogenomics knowledge for personalized medicine. Clin Pharmacol Ther. 110 (3), 563-572 (2021).
  23. Zhou, Y., et al. Ttd: Therapeutic target database describing target druggability information. Nucleic Acids Res. 52 (D1), D1465-D1477 (2024).
  24. Knox, C., et al. Drugbank 6.0: The drugbank knowledgebase for 2024. Nuc Acid Res. 52 (D1), D1265-D1275 (2024).
  25. Rendi, M. H., Muehlenbachs, A., Garcia, R. L., Boyd, K. L. . Comparative anatomy and histology a mouse and human atlas. Chapter 17, 253-284 (2012).
  26. Chen, S. X. R. B. X. . Pharmacology experimental methodology. , (2002).
  27. Black, D. M., Rosen, C. J. Clinical practice. Postmenopausal osteoporosis. N Engl J Med. 374 (3), 254-262 (2016).
  28. Cummings, S. R., Melton, L. J. Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures. Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).
  29. Walker, M. D., Shane, E. Postmenopausal osteoporosis. N Engl J Med. 389 (21), 1979-1991 (2023).
  30. Hwang, Y. H., Jang, S. A., Lee, A., Kim, T., Ha, H. Poria cocos ameliorates bone loss in ovariectomized mice and inhibits osteoclastogenesis in vitro. Nutrients. 12 (5), 1383 (2020).
  31. Ling, X., et al. Shu-di-huang and gan-cao herb pair restored the differentiation potentials of mesenchymal stem progenitors in treating osteoporosis via downregulation of nf-κb signaling pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 7795527 (2021).
  32. Zhou, L. P., et al. protective effects of danggui buxue tang alone and in combination with tamoxifen or raloxifene in vivo and in vitro. Front Pharmacol. 9, 779 (2018).
  33. Huangfu, L., Li, R., Huang, Y., Wang, S. The il-17 family in diseases: From bench to bedside. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 402 (2023).
  34. Majumder, S., Mcgeachy, M. J. Il-17 in the pathogenesis of disease: Good intentions gone awry. Annu Rev Immunol. 39, 537-556 (2021).
  35. Le Goff, B., et al. Implication of il-17 in bone loss and structural damage in inflammatory rheumatic diseases. Mediators Inflamm. 2019, 8659302 (2019).
  36. Zhang, J. R., et al. Different modulatory effects of il-17, il-22, and il-23 on osteoblast differentiation. Mediators Inflamm. 2017, 5950395 (2017).
  37. Peng, R., et al. Il-17 promotes osteoclast-induced bone loss by regulating glutamine-dependent energy metabolism. Cell Death Dis. 15 (2), 111 (2024).
  38. Sato, K., et al. Th17 functions as an osteoclastogenic helper t cell subset that links t cell activation and bone destruction. J Exp Med. 203 (12), 2673-2682 (2006).
  39. Shetty, S., Kapoor, N., Bondu, J. D., Thomas, N., Paul, T. V. Bone turnover markers: Emerging tool in the management of osteoporosis. Indian J Endocrinol Metab. 20 (6), 846-852 (2016).
  40. Selvaraj, V., Sekaran, S., Dhanasekaran, A., Warrier, S. Type 1 collagen: Synthesis, structure and key functions in bone mineralization. Differentiation. 136, 100757 (2024).
  41. Hu, T., et al. Xiaoyao san attenuates hepatic steatosis through estrogen receptor α pathway in ovariectomized apoe-/- mice. J Ethnopharmacol. 282, 114612 (2022).
  42. Ramchand, S. K., Leder, B. Z. Sequential therapy for the long-term treatment of postmenopausal osteoporosis. J Clin Endocrinol Metab. 109 (2), 303-311 (2024).
  43. Schroeder, R. J., et al. Oral therapeutics post menopausal osteoporosis. Cureus. 15 (8), e42870 (2023).
  44. Patel, D., Gorrell, C., Norris, J., Liu, J. A narrative review of the pharmaceutical management of osteoporosis. Ann Jt. 8, 25 (2023).
  45. Minisola, S. Denosumab discontinuation: Covid-19 pandemic and beyond. JBMR Plus. 8 (7), ziae046 (2024).
  46. ACOG Committee on Clinical Practice Guidelines-Gynecology. Management of postmenopausal osteoporosis: ACOG clinical practice guideline no. 2. Obstet Gynecol. 139 (4), 698-717 (2022).
  47. Peng, Z., Xu, R., You, Q. Role of traditional Chinese medicine in bone regeneration and osteoporosis. Front Bioeng Biotechnol. 10, 911326 (2022).
  48. Li, J., et al. Clinical practice of traditional Chinese medicine for the treatment of postmenopausal osteoporosis: A literature review. Climacteric. 25 (6), 562-569 (2022).
  49. Zhang, N. D., et al. Traditional Chinese medicine formulas for the treatment of osteoporosis: Implication for antiosteoporotic drug discovery. J Ethnopharmacol. 189, 61-80 (2016).
  50. Ping, R., et al. Identifying the effective combination of acupuncture and traditional Chinese medicinal herbs for postmenopausal osteoporosis therapy through studies of their molecular regulation of bone homeostasis. J Tradit Chin Med. 44 (1), 212-219 (2024).
  51. Li, B., Jiang, C., Zhan, X. Combined therapy of yishen zhuanggu decoction and caltrate d600 alleviates postmenopausal osteoporosis by targeting foxo3a and activating the wnt/β-catenin pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2022, 7732508 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE210

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved