생쥐의 폐경 후 골다공증 치료에서 Xiaoyao 알약의 항염증 효과에 관한 연구

요약

폐경 후 골다공증은 전 세계적인 공중 보건 문제가 되었습니다. 이 연구의 목적은 이 상태에 대한 중국 전통 의학 Xiaoyao 알약의 치료 효과 및 관련 메커니즘을 탐구하는 것입니다.

초록

골다공증은 노인 및 폐경 후 여성에게 흔한 대사 질환으로, 초기에는 뚜렷한 증상이 없습니다. 이 상태의 후반기에 환자는 골절되기 쉬우며, 이는 환자의 건강과 삶의 질에 심각한 영향을 미칠 수 있습니다. 전 세계적으로 기대 수명이 증가함에 따라 골다공증은 세계적인 관심사가 되었습니다. Xiaoyao 알약은 이전에
우울증 치료에 사용됩니다. 또한, 이 약물은 에스트로겐과 유사한 활성을 가지고 있는 것으로 나타났으며, 이는 초기 조골세포 특이적 마커인 ALP와 뼈 세포외 기질의 주요 구성 요소인 COL-1의 발현에 영향을 미쳤습니다. Xiaoyao 알약은 쥐의 폐경 후 골다공증(PMOM)에 대한 효과를 평가했습니다. Xiaoyao 알약의 각 허브 성분의 대상 정보는 TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology) 데이터베이스를 통해 액세스되었습니다. GeneCards, OMIM, PharmGkb, TTD, DrugBank 및 기타 웹사이트의 정보를 사용하여 단백질 상호 작용을 평가하기 위해 Cytoscape 및 String 네트워크를 통해 허브 복합체의 조절 네트워크를 구축했습니다. 생쥐를 난소 절제술하고 고용량 및 저용량의 Xiaoyao 알약으로 치료했으며 이를 대조군과 비교했습니다. 그들의 증상은 뼈 조직의 면역세포화학으로 평가되었습니다. 그 결과, 샤오야오 알약이 IL-17 신호전달 경로를 통해 난소절제술을 받은 쥐에서 PMOM 증상을 완화할 수 있는 능력이 있음을 시사했다. 이 약물은 골다공증 치료를 위한 새로운 치료제가 될 가능성이 있습니다.

서문

세계보건기구(WHO)는 골다공증(osteoporosis, OP)을 골량의 감소와 뼈 조직의 미세구조(microstructure)의 저하를 특징으로 하는 질병으로 정의하며, 이로 인해 뼈가 부서지기 쉬워지고 골절의 위험이 증가한다¹. 골다공증의 임상적 중요성은 골절로 이어질 수 있다는 것이며, 이는 높은 사망률, 이환율 및 경제적 비용과 관련이 있습니다². 폐경 후 골다공증(PMOP)은 폐경 후 여성의 에스트로겐 수치가 감소하여 파골세포 활동이 증가하여 뼈 손실과 뼈 미세 구조의 파괴를 초래합니다. 이는 종종 건강에 심각한 영향을 미치는 골다공증을 유발한다³. PMOP에 대한 현재 치료법에는 에스트로겐 대체 요법, 비스포스포네이트 및 부갑상선 호르몬이 포함되지만 부작용의 정도가 다양하고 장기적인 순응도가 불충분하며 비용이 많이 들 수 있습니다⁴. 따라서 저렴한 약초는 인구의 많은 비율에게 실행 가능한 대안입니다.

샤오야오 알약은 중국 약전⁵에 포함되어 있으며, 여기에는 Chai Hu, Angelica sinensis, White paeonia lactiflora, Atractylodes macrocephala, Poria cocos, Menthae Herba, 감초, 신선한 생강 등 8가지 허브 성분이 포함되어 있습니다. 이 모든 허브는 간을 해독하고 비장을 강화하며 혈액에 영양을 공급하고 월경 주기를 조절하는 데 효과적인 것으로 알려져 있으며 우울증 치료에도 사용되었습니다⁶. 그러나 골다공증에서 Xiaoyao 알약의 역할은 불분명합니다.

초기 연구에 따르면 염증은^{뼈 손실로} 이어질 수 있으며7 이 과정과 관련된 골밀도 감소는 폐경기에 의해 가속화될 수 있다고 합니다. 또한 골다공증의 발병과 염증 사이에는 강한 관계가 있습니다. 염증 인자인 인터루킨-17(IL-17)은 CD4+ T 림프구의 하위 집합인 Th17 세포에서 분비되는 전염증 인자입니다. 이 세포는 여러 만성 염증성 질환과 관련이 있으며, 류마티스 관절염에서 뼈 파괴 진행에 중요한 역할을 한다⁸. 또한 IL-17은 골쇄골 형성을 조절하는 핵 인자-κ B 리간드 수용체 활성제(RANKL)를 자극하여 골 형성보다 더 큰 골 흡수를 유도합니다⁹. IL-17은 TNFα, IL-1, IL-6 및 IL-8과 같은 다른 골쇄골 사이토카인의 발현을 자극합니다. 다른 염증 요인과 시너지 효과를 낼 수 있는 능력이 있어 중요한 염증 효과 인자(inflammatory effector)가 된다¹⁰.

연구에 따르면 샤오야오 알약과 염증 사이의 연관성도 밝혀졌습니다. Shi et ^al.11 및 Fang et ^al.12 는 최근 Xiaoyao 알약이 각각 IL-6 및 TNF-α 수치를 낮출 수 있음을 확인했습니다. 대사 관련 지방간염에 대한 또 다른 연구에서는 Xiaoyao 알약이 프로피온산의 발현을 상향 조절할 수 있으며, 이는 TNF-α의 발현을 억제하고 항염증 효과를 발휘할 수 있다고 보고되었습니다¹³. 그러나 현재로서는 샤오야오 알약이 이번 연구의 목적인 IL-17을 통해 염증 반응을 매개하여 PMOM의 발병을 조절할 수 있는지는 알려져 있지 않다.

본 연구는 네트워크 약리학 및 생물정보학 분석을 통해 샤오야오 알약의 표적과 골다공증 관련 유전자의 교차점을 예측하고, 교차하는 유전자를 분석하여 단백질 상호작용, GO, KEGG를 분석하였다. 예측된 결과를 바탕으로 IL-17 신호전달 경로의 핵심 단백질인 Act1 및 IL-6의 발현을 관찰할 수 있으며^14,15 뼈 회전율 마커인 ALP⁽Alkaline Phosphatase) 및 COL-1(Collagen type I)을 관찰하여 PMOM 마우스 모델에서 Xiaoyao 알약의 치료 효능을 관찰할 수 있습니다.

프로토콜

유강의과대학 실험동물윤리위원회는 연구계획서(승인번호: 2022101502)를 승인했다. 10-12주령의 SPF 등급 및 체중(22 ± 2) g의 암컷 C57BL/6 마우스를 Youjiang Medical University for Nationalities의 SPF Class 동물 실험 센터에 수용하였다. 실험동물은 24-26°C의 온도와 55% 내지 60%의 상대습도로 유지하였다.

1. 중국 전통 의학 시스템 약리학 데이터베이스 및 분석 플랫폼

참고: Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)은 한의학 약리학 플랫폼으로, TCM 성분, ADME 관련 특성, 표적 및 질병에 대한 정보를 포함하고 있다^16,17.

1. TCMSP 웹 인터페이스에 액세스합니다. 허브의 이름을 검색하고 한약의 이름을 입력한 후 검색을 클릭합니다. 검색 결과에서 Latin Name(라틴 이름 )을 클릭합니다. 매개변수 OB ≥ 30% 및 DL ≥ 0.18로 성분 결과에 대한 스크리닝을 수행합니다.
2. 모든 결과를 복사하여 Chinese Medicine Name_ingredients.txt이라는 TXT 형식으로 저장합니다.
3. 관련 타겟 탭의 타겟 정보에서 Mol ID(즉, 1.2단계의 결과)를 필터링합니다.
4. 필터링된 결과를 복사하여 Chinese Medicine Name_targets.txt이라는 TXT 형식으로 저장합니다.
   참고: 위의 단계를 통해 중국 전통 의학(TCM)의 모든 적격 활성 성분 및 해당 목표 정보를 얻었습니다.
5. 위의 ingredients.txt 파일과 targets.txt 파일을 모두 같은 폴더에 넣고 Perl 스크립트(보충 코딩 파일 1)를 해당 폴더에 넣습니다.
6. CMD를 열고 cd 폴더 경로를 입력한 다음 Perl 스크립트를 실행합니다. 새 텍스트 파일(allTargets.txt)을 가져옵니다. 이 새 텍스트 파일(allTargets.txt)에는 허브 이름, 성분 이름, 성분 ID 및 목표가 포함되어 있습니다.

2. UniProt 데이터베이스

참고: UniProt 데이터베이스(https://www.uniprot.org/)에는 기능 정보가 주석이 달린 인간 단백질 서열이 포함되어 있으며 표적의 이름을 공식 이름¹⁸로 정규화하는 데 사용됩니다.

1. UniProt 웹 인터페이스로 이동합니다. 검색 탭을 클릭하고 UniProtKB를 선택한 다음 검색을 클릭합니다.
2. 왼쪽 사이드바에서 필터링하고 상태에 대해 검토됨(Swiss-Prot) 을 선택하고 인기 있는 유기체에 대해 인간 을 선택합니다. Download(다운로드)를 클릭하고, Download All(모두 다운로드)을 선택하고, Format(형식)으로 TSV 를 선택하고, Download(다운로드 )를 클릭하여 주석 파일을 다운로드합니다.
3. 다운로드한 파일을 현재 폴더에 압축 해제하고, 압축을 푼 파일을 열고, ann.txt라는 텍스트 파일에 복사하여 붙여 넣습니다.

3. 약물 타겟 ID 변환

1. 섹션 1에서 얻은 모든 약물 표적 파일과 섹션 2에서 얻은 UniProt 주석 파일 ann.txt allTargets.txt 폴더에 넣고 Perl 스크립트(보충 코딩 파일 2)를 넣습니다.
2. CMD를 열고 cd + space + folder path를 입력하고 입력 한 다음 Perl 스크립트를 실행하여 새 텍스트 파일 (allTargets.symbol.txt)을 얻습니다. 이 새로운 텍스트 파일(allTargets.symbol.txt)에는 허브 이름, 성분 ID, 성분 이름 및 유전자 ID가 포함되어 있습니다.

4. 데이터베이스 검색

1. GeneCards: 인간 유전자 데이터베이스(GeneCards) 데이터베이스
   참고: GeneCards 데이터베이스(https://www.genecards.org/)는 인간 유전자에 대한 예측 및 주석 정보를 제공합니다. 질병 표적^19,20에 액세스하는 데 사용됩니다.
   1. GeneCards 웹 인터페이스로 이동합니다. 검색 상자에 osteoporosis를 입력하고 Search(검색)를 클릭합니다.
   2. 내보내기를 클릭하고 Excel로 내보내기를 선택합니다.
   3. 다운로드한 파일을 열고 관련성 점수가 1≥ 유전자를 복사한 다음 GeneCards.txt이라는 파일에 붙여넣어 저장합니다.
2. OMIM 데이터베이스
   참고: OMIM 데이터베이스(https://omim.org)에는 인간 유전자, 유전 질환 및 특성이 포함되어 있습니다²¹.
   1. OMIM 웹 인터페이스로 이동합니다. GENE Map을 클릭하고 검색 상자에 osteoporosis를 입력한 다음 Search를 클릭합니다.
   2. 다른 이름으로 다운로드를 클릭하고 Excel 파일을 선택합니다.
   3. 다운로드한 파일을 열고 Approved Symbol 열의 유전자 이름을 복사하여 붙여넣은 다음 OMIM.txt라는 파일에 저장합니다.
3. PharmGkb 데이터베이스
   참고: 약물유전체학 지식 기반인 PharmGkb(https://www.pharmgkb.org)에는 약물 라벨 주석, 약물 중심 경로, 약물유전학 요약 및 유전자, 약물 및 질병 간의 관계가 포함되어 있습니다²².
   1. PharmGkb 웹 사이트 인터페이스로 이동합니다. 검색창에 골다공증을 입력하고 검색을 클릭한 후 왼쪽 사이드바에서 유전자 를 선택합니다.
   2. 모든 결과를 수동으로 입력하고 PharmGkb.txt라는 파일에 저장합니다.
4. TTD: 치료 대상 데이터베이스(TTD) 데이터베이스
   참고: TTD 데이터베이스(https://idrblab.org/ttd/)는 단백질 및 핵산 표적, 표적 질병, 경로 정보 및 각 표적에 대한 해당 약물에 대한 정보를 제공합니다(²³).
   1. TTD 웹 인터페이스로 이동합니다. 검색 상자에 osteoporosis를 입력하고 Search(검색)를 클릭합니다.
   2. 결과의 대상 ID 아래에 있는 대상 정보를 클릭하고 대상 이름을 복사하여 붙여넣은 다음 TTD.txt이라는 파일에 저장합니다. 총 33개의 결과를 얻었습니다. 각 결과를 같은 방식으로 저장합니다.
5. DrugBank Online(DrugBank) 데이터베이스
   참고: DrugBank 데이터베이스(https://go.drugbank.com)에는 약물 및 약물 표적, 약물 상호 작용, 약물 메커니즘 및 약물 대사에 대한 정보가 포함되어 있습니다²⁴.
   1. DrugBank 웹사이트 인터페이스로 이동합니다. 검색 탭에서 Indications(적응증 )를 선택하고 검색 상자에 osteoporosis를 입력한 다음 Search( 검색)를 클릭합니다.
   2. 자세한 내용을 보려면 결과에서 골다공증 항목을 클릭하고, DRUGS AND TARGETS 탭을 클릭하고, 표의 TARGET 열에서 해당 링크를 클릭하십시오.
   3. Protein(단백질)에서 Details(세부 정보)를 클릭하고 Gene Name(유전자 이름)을 복사하여 붙여 넣은 다음 DrugBank.txt이라는 파일에 저장합니다. 각 결과를 같은 방식으로 저장합니다.

5. 벤 다이어그램

1. 질병 관련 유전자 병합 및 Venn mapping
   1. 저장된 txt 파일과 스크립트를 같은 폴더에 넣습니다.
   2. R 코드(Merge Disease-Related Genes)를 열고 위의 txt 파일이 저장된 경로를 R 코드에서 setwd가 있는 줄에 복사하여 붙여넣습니다.
   3. R 소프트웨어를 열고, 수정된 R 코드를 실행하고, 저장합니다. 유전자를 설정하고 파일 이름을 Disease.txt.
   4. Draw Venn Diagram 웹 사이트를 엽니다. 입력 섹션에서 섹션 4에서 8까지 저장된 텍스트 내용을 복사하여 목록에 하나씩 붙여넣고 해당 데이터베이스로 이름을 지정한 다음 Submit을 클릭합니다.
   5. 이미지 아래의 PNG로 이미지 저장 을 클릭하고 텍스트 결과를 동일한 폴더에 저장합니다.
2. 약물 표적과 질병 관련 유전자의 교차점
   1. 섹션 3에서 얻은 allTargets.symbol.txt 파일과 5.1.3단계에서 얻은 Disease.txt 파일을 같은 폴더에 넣습니다.
   2. R 코드(약물 표적과 질병 관련 유전자가 교차함)를 열고 위의 txt 파일이 저장된 경로를 R 코드에서 setwd가 있는 줄에 복사하여 붙여넣습니다.
   3. R 소프트웨어를 열고, 수정된 R 코드를 실행하고, 저장합니다. 유전자를 설정하고 파일 이름을 Drug_Disease.txt.
   4. Draw Venn Diagram 웹 사이트를 엽니다. 입력 섹션에서 allTargets.symbol.txt 및 Disease.txt를 복사하여 목록에 붙여넣고 해당 파일의 이름을 따서 이름을 지정합니다.
   5. 이미지 아래의 PNG로 이미지 저장 을 클릭하고 텍스트 결과를 동일한 폴더에 저장합니다.

6. TCM 컴파운딩의 규제 네트워크 구축

1. 섹션 3에서 얻은 allTargets.symbol.txt 파일을 Disease.txt 파일 및 해당 Perl 스크립트(보충 코딩 파일 3)와 동일한 폴더에 배치합니다.
2. CMD를 열고, cd 파일 경로를 입력하고, Enter 키를 누르고, Perl 스크립트를 실행한다. 4개의 새로운 txt 파일(net.geneLists.txt, net.molLists.txt, net.network.txt 및 net.type.txt)을 가져옵니다. network.txt 파일에는 TCM 성분 ID, 표적 유전자, 표적 관계 및 성분 이름이 포함되어 있습니다. net.type.txt에는 노드 이름, 속성 및 소속이 포함됩니다. net.geneLists.txt는 유전자의 목록이고, net.molLists.txt는 성분의 목록이다.
3. 새로 얻은 텍스트 파일을 동일한 새 폴더에 복사합니다.
4. Cytoscape 3.9.1 소프트웨어를 열고 파일, 가져오기를 차례로 클릭한 다음 네트워크 양식 파일을 선택합니다. net.network.txt 선택하고 Component ID의 첫 번째 열을 Source Node로, Genes의 두 번째 열을 Target Node로, Targeting Relationship의 세 번째 열을 Interaction Type으로 입력한 후 OK를 클릭합니다.
5. 노드 테이블 창에서 net.type.txt 가져옵니다. 선택 탭을 클릭하고, 노드를 선택하고, ID 목록 파일에서를 선택하고, net.geneLists.txt을 선택하고, 열기를 클릭합니다.
6. 레이아웃(Layout) 탭을 클릭하고 각도 정렬된 원 레이아웃(Degree Sorted Circle Layout)을 선택한 다음 선택한 노드만(Selected Nodes Only)을 선택합니다. 노드의 높이와 너비를 모두 70으로 조정합니다.
7. 높이(Height)에서 두 번째 상자(Second Box)를 클릭하고, 열(Column)에서 degree.layout을 선택하고, 매핑 유형(Mapping Type)에서 연속 매핑(Continuous Mapping)을 선택하고, 현재 매핑(Current Mapping)의 오른쪽에 있는 높이 조정 창(Height Adjustment Window)을 두 번 클릭하여 높이의 상한과 하한을 적절한 범위로 조정합니다.
8. 너비 옵션을 사용하여 작업을 반복합니다.
9. 레이아웃(Layout) 탭을 다시 클릭하고 레이아웃 도구(Layout Tools) > 노드가 겹치지 않도록 스케일을 조정합니다.
10. 소프트웨어의 오른쪽 상단 창을 클릭하여 노드 네트워크를 선택 취소하고 선택 탭을 클릭하고 노드를 선택하고 ID 목록 파일에서를 선택하고 net.molLists.txt 선택한 다음 열기를 클릭합니다.
11. 레이아웃(Layout) 탭을 클릭하고, 그룹 속성 레이아웃(Group Attributes Layout)을 선택하고, 선택한 노드만(Selected Nodes Only)을 선택하고, 유형(Type)을 클릭합니다.
12. 왼쪽 열에서 Label Font Size 를 클릭하고 Default Value를 12로 설정합니다. 왼쪽 열의 이미지/차트 1에서 기본값 을 클릭합니다.
13. 팝업 창에서 차트를 선택하고 파이 차트를 클릭한 다음 사용 가능한 열 열에서 각도를 제외한 항목을 선택합니다. Layout(레이아웃)을 선택하고 Apply(적용)를 클릭합니다.
14. 왼쪽 열에서 Border Paint 를 클릭하고 Default Value 를 #003EF8 설정합니다. 왼쪽 사이드바 하단의 가장자리 탭을 클릭하고 너비를 0.8로 설정합니다.
15. 상단 도구 모음에서 File(파일)을 클릭하고 Export(내보내기)를 선택한 다음 Network to Image(네트워크)를 선택합니다.
16. 팝업 창에서 형식으로 PNG 형식을 선택하고, 저장 디렉토리를 선택하고, 이미지 네트워크 이름을 지정하고, 이미지 크기 확대를 최대 500%로 조정하고, 투명 배경을 선택하고, 확인을 클릭하여 이미지 저장을 마칩니다.

7. 단백질-단백질 상호 작용 네트워크(PPI) 구성

1. STRING 웹 사이트(https://string-db.org/)를 열고, Multiple Protein을 클릭하고, 파일 업로드에서 찾아보기를 클릭하고, 5.2.3단계에서 얻은 Drug_Disease.txt 파일을 선택하고, Organisms에서 Homo sapiens 를 선택합니다. Search(검색 )를 클릭하고 Continue(계속)를 클릭합니다.
2. 설정을 클릭하고, 필요한 최소 상호 작용 점수를 가장 높은 신뢰도(0.900)로 설정하고, 네트워크 표시 옵션에서 네트워크에서 연결이 끊긴 노드 숨기기를 선택합니다. Update(업데이트)를 클릭합니다.
3. 네트워크 다이어그램의 노드를 조정하여 겹치거나 폐색되지 않도록 합니다.
4. Exports(내보내기)를 클릭하고 Download(고해상도) 비트맵으로 다운로드를 클릭하여 단백질 인터워킹 네트워크 맵을 PNG 형식으로 가져옵니다. 또한 TSV 파일을 짧은 표 형식의 텍스트 출력으로 다운로드합니다. 두 파일을 모두 통합 폴더에 저장합니다. TSV 파일에는 유전자 이름, STRING 내부 ID 및 다양한 속성에 대한 점수가 포함되어 있습니다.

8. PPI 네트워크 코어 구축

1. 섹션 7에서 얻은 TSV 파일과 필요한 Perl 스크립트를 새 폴더에 넣습니다.
2. Cytoscape 3.9.1 소프트웨어를 열고, 파일을 클릭하고, 가져오기를 선택하고, 파일에서 네트워크를 클릭하고, 위의 TSV 파일을 선택하고, 첫 번째 열 node1을 소스 노드로, 두 번째 열 node2를 대상 노드로 입력하고, 확인을 클릭합니다.
3. 왼쪽 사이드바에서 스타일을 클릭하고 너비에서 기본값 을 클릭한 다음 60으로 설정합니다. 노드들을 드래그 앤 드롭하여 네트워크에 겹치거나 폐색이 없도록 합니다.
4. 위쪽 도구 모음에서 APPs 를 클릭하고 CytoNCA를 클릭한 다음 Open을 클릭합니다.
5. 왼쪽 열의 Betweenness(매개체), Closeness(근접성), Degree(정도), Eigenvector(고유 벡터), Local Average Connectivity-based method(로컬 평균 연결성 기반 방법) 및 Network(네트워크)에서 Without Weight(가중치 없음 )를 선택하고 Analyze(분석)를 클릭합니다.
6. 분석이 완료되면 오른쪽 하단 창에서 노드 테이블을 클릭하고, 내보내기를 클릭하고, 폴더에 저장하고, 이름을 score 1로 지정합니다.
   참고: CytoNCA 플러그인은 Cytoscape 소프트웨어에 설치해야 합니다. 이렇게 하려면 위쪽 도구 모음에서 앱을 클릭하고, 앱 관리자를 클릭하고, 검색 상자에 CytoNCA를 입력하고, 반환된 결과의 중간 열에서 CytoNCA 를 선택하고, 설치를 클릭합니다.
7. score1을 열고, 이름 열을 첫 번째 열로 조정하고, 테이블의 정보를 복사하고, 새 텍스트 파일에 붙여 넣고, 이름을 score1.txt으로 지정하고, 저장합니다.
8. R 코드를 열고 score1.txt 파일이 있는 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd가 있는 줄에 붙여넣습니다.
9. R 소프트웨어를 열고 수정된 코드를 실행하여 score2.txt와 score2.gene.txt이라는 두 개의 새 파일을 가져옵니다. score2.txt 파일에는 모든 프로그램 점수가 중앙값보다 큰 유전자와 각 프로그램에 대한 특정 점수가 포함되어 있습니다. score2.gene.txt에는 모든 항목에 대해 중앙값보다 높은 점수를 받은 유전자가 포함되어 있습니다.
10. Cytoscape에서 계속하려면 오른쪽 하단 창에서 분석(Analysis) 패널 1 을 클릭하고, 창 왼쪽에서 파일에서 업로드(Upload From File )를 클릭하고, score2.gene.txt 선택하고, 열기(Open)를 클릭하고, 팝업 창에서 확인(OK )을 누릅니다.
11. 하단의 Select Nodes 를 클릭하고 팝업 창에서 OK 를 클릭합니다.
12. 상단 도구 모음에서 파일을 클릭하고, 내보내기를 선택하고, 네트워크를 이미지로를 클릭하고, 이미지 크기의 확대/축소(%)를 최대 500%로 조정하고, 투명 배경을 선택하고, 파일을 동일한 폴더에 저장하고 이름을 network1로 지정합니다.
13. 하단 창의 오른쪽 사이드바에서 Create Sub-Network 를 클릭하여 하위 네트워크를 생성하고, 하위 네트워크를 분석하고, 상단 도구 모음에서 APPs 를 클릭하고, CytoNCA 를 클릭하고, Open을 클릭합니다.
14. 왼쪽 사이드바의 Betweenness(간격), Closeness(근접성), Degree(정도), Eigenvector(고유벡터), Local Average Connectivity-based method(로컬 평균 연결성 기반 방법) 및 Network(네트워크)에서 Without Weight(가중치 없음 )를 선택하고 Analyze(분석)를 클릭합니다.
15. 분석이 완료되면 오른쪽 아래 창에서 노드 테이블을 클릭하고 내보내기를 클릭한 다음 score2라는 새 폴더에 저장합니다.
16. score2를 열고, 이름 열을 첫 번째 열로 조정하고, 테이블의 정보를 복사하고, 새 텍스트 파일에 붙여 넣고, 이름을 score2.txt으로 지정하고, 저장합니다.
17. R 코드를 열고 score2.txt 파일이 있는 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd가 있는 줄에 붙여넣습니다.
18. R 소프트웨어를 열고 수정된 코드를 실행하여 score3.txt와 score3.gene.txt이라는 두 개의 새 파일을 가져옵니다. score3.txt 파일에는 모든 항목에 대한 중앙값보다 높은 점수를 받은 유전자와 각 항목에 대한 특정 점수가 포함되어 있습니다. score3.gene.txt에는 모든 항목에 대해 중앙값보다 높은 점수를 받은 유전자가 포함되어 있습니다.
19. Cytoscape에서 계속하려면 오른쪽 하단 창에서 AnalysisPanel 1 을 클릭하고, 창 왼쪽에서 파일에서 업로드 를 클릭하고, score3.gene.txt 선택하고, 열기를 클릭하고, 팝업 창에서 확인을 누릅니다.
20. 하단의 Select Nodes 를 클릭하고 팝업 창에서 OK 를 클릭합니다.
21. 상단 도구 모음에서 파일을 클릭하고, 내보내기를 선택하고, 네트워크를 이미지로를 클릭하고, 이미지 크기의 확대/축소(%)를 500%로 조정하고, 투명 배경을 선택하고, 이 단계에서 사용한 것과 동일한 폴더에 파일을 저장하고 이름을 network2로 지정합니다.
22. 아래 창의 오른쪽 사이드바에서 Create Sub-Network(서브 네트워크 생성 )를 클릭하여 서브 네트워크를 생성합니다.
23. 맨 위의 도구 모음에서 파일을 클릭하고, 내보내기를 선택하고, 네트워크를 이미지로를 클릭하고, 이미지 크기의 확대/축소(%)를 최대 500%로 조정하고, 투명 배경을 선택하고, 이 단계에서 사용한 것과 동일한 폴더에 파일을 저장하고 이름을 network3으로 지정합니다.

9. 유전자 ID 변환

1. 필요한 코드 파일과 동일한 새 폴더에 Drug_Disease.txt 파일을 배치합니다.
2. R 코드(추가 코딩 파일 4)를 열고 Drug_Disease.txt 파일이 있는 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd가 있는 줄에 붙여넣습니다.
3. R 소프트웨어를 열고 org를 사용하여 수정된 코드를 실행합니다. Hs.eg.db 패키지를 사용하여 유전자 ID를 변환하고 새 파일 id.txt 완료된 후 실행합니다. id.txt에는 유전자의 기호와 해당 ID가 포함되어 있습니다.

10. GO 농축 분석

1. 이전 단계의 id.txt 파일을 GO 농축 분석 코드와 동일한 폴더에 배치합니다.
2. R 코드(보충 코딩 파일 5)를 열고 작업 디렉토리를 id.txt로 설정하고 GO 코드가 저장된 경로를 설정합니다.
3. R 소프트웨어를 열고, 수정된 코드를 실행하고, clusterProfiler, org를 사용합니다. Hs.eg.db 플롯, ggplot2 플롯, GO 강화 분석 히스토그램 및 버블 플롯을 풍부하게 합니다. 실행이 완료된 후 GO.txt, barplot.pdf 및 bubble.pdf의 세 가지 새 파일을 가져옵니다.
   참고: GO.txt은 농축 분류(BP, CC, MF), GO ID, GO 이름, 유전자 비율, 배경 비율, 농축 유의성 p-값, 수정된 p-값(p.adjust, 값), 유전자 ID(이름) 및 각 GO에서 농축된 유전자 수를 포함하는 농축 결과 파일입니다. barplot.pdf는 히스토그램 버블입니다. pdf는 버블 플롯입니다.

11. KEGG 농축 분석

1. id.txt 파일을 KEGG 농축 분석 코드와 동일한 폴더에 배치합니다.
2. R 코드(보충 코딩 파일 6)를 열고 작업 디렉토리를 id.txt 및 KEGG 코드가 저장된 경로로 설정합니다.
3. R 소프트웨어를 열고, 수정된 코드를 실행하고, clusterProfiler, org를 사용합니다. GO 농축 분석 히스토그램, 버블 플롯 및 경로 플롯을 플로팅하는 Hs.eg.db, enrichplot, ggplot2 패키지. 실행은 KEGG.txt, barplot.pdf 및 bubble.pdf의 세 가지 새 파일을 생성하여 완료됩니다.
   참고: KEGG.txt 파일은 경로 ID, 경로 설명, 유전자 비율, 배경 비율, 농축 유의성 p-값, 보정된 p-값(p.adjust, qvalue), 유전자 ID(이름) 및 각 경로에서 농축된 유전자 수를 포함하는 농축 결과 파일입니다. barplot.pdf는 막대 차트이고 bubble.pdf는 거품형 차트입니다.
4. KEGG.txt 파일에서 IL-17을 검색하십시오. 결과는 경로가 하나뿐임을 보여줍니다. 경로 ID를 복사합니다.
5. R 코드를 열고, KEGID에 IL-17 경로 ID를 붙여넣고, pathview 패키지를 사용하여 경로 맵에 레이블을 지정합니다. 수정된 R 코드를 실행하고 hsa04657.pathview.png와 hsa04657.png라는 두 개의 새 파일을 가져옵니다.
   참고: hsa04657.png 파일은 경로 맵, hsa04657.pathview.png 레이블이 지정된 경로 맵, 빨간색으로 표시된 파일은 상호 작용 네트워크에 존재하는 유전자입니다.

12. Xiaoyao 알약의 준비

참고: 사용된 제조 방법은 중국 약전⁵를 참조하십시오.

1. 차이후 100g, 당귀 100g, 백골 100g, 백 골 100g, 볶음 Atractylodes macrocephala, 포리아 코코스 100g, 기수 감초 준비산 80g, 멘테 허브 20g을 섭취합니다.
2. 맷돌 분쇄기 또는 분말 기계를 사용하여 허브를 미세한 분말로 분쇄하십시오. 여러 허브를 위의 비율로 결합하고 미세한 분말로 분쇄하여 자연스럽게 섞습니다. 내경이 80 μm ± 180 μm 인 7.6 메쉬 약물 체를 사용하여 분쇄 된 분말을 체로 걸러냅니다. 잘 섞는다.
3. 생강 100g에 물을 넣고 매번 20분씩 2번 끓인다. 걸러내고 따로 보관하십시오.
4. 약패를 채취하여 작은 빗자루를 생강 물에 담근 후 플라크에 솔질하고 위의 가루를 취하여 생강수에 뿌린 후 플라크를 뒤집어 분말이 모두 젖도록 하여 공 모양으로 성형할 수 있습니다.
   참고: 약용 플라크의 형성은 TCM 알약을 준비하는 동안 필수적인 단계입니다. 대부분의 모소 대나무는 스트립으로 쪼개져 골격으로 짜여집니다. 대나무 껍질 또는 텡피는 표면에 짜여져 둥글게 됩니다. 플라크의 표면은 텅 오일로 얇게 코팅 한 다음 바니시 층으로 닦아야합니다. 이것은 방수 되도록 건조됩니다. 이런 식으로 만든 알약은 둥글고 매끄럽습니다.
5. 생강 물을 다시 솔질하고 분말을 뿌리고 플라크를 회전시켜 약물이 점차 둥글고 확대되도록 합니다. 건조를 위해 서늘한 곳에 두십시오.

13. 동물모형의 확립

1. 7일간의 순응 후 실험용 마우스를 4개 그룹, 즉 가짜 작업 그룹(가짜, 난소 주변의 지방만 제거한 그룹)과 모델 그룹(OVX)으로 구성된 난소 절제술 마우스의 3개 그룹과 저농도 및 고농도 Xiaoyao 알약 투여 그룹으로 무작위로 나눕니다.
2. 복강내로 주입된 3% 펜토바르비탈나트륨(40mg/kg)으로 마우스를 마취합니다. 전신 근육 이완, 깊고 느린 호흡, 느린 움직임을 관찰하여 쥐가 마취 상태에 들어가는지 확인하십시오. 수술 전에 쥐의 눈에 눈 연고를 바릅니다.
3. 동물을 엎드린 자세에 놓고 동물 면도기로 등의 신장 부위를 면도합니다. 75% 에탄올로 국소 소독을 수행합니다.
4. 콩팥의 등쪽 부위에 가까운 양측으로 약 1cm의 세로로 절개하고 근막을 절개하여 근육과 복막을 분리합니다.
5. 자궁 뿔의 윗부분과 나팔관을 찾아 결찰합니다. 탐색을 위해 절개 부위에 겸자를 삽입하고 밝은 빨간색 콜리플라워 패턴으로 지방 조직으로 둘러싸인 난소를 찾고 난소 아래에 나선형으로 배열된 나팔관이 있어 난소를 자궁 뿔과 연결합니다²⁵. 수술용 가위와 봉합사로 난소를 제거합니다.
6. 가짜 수술 그룹의 대조군으로 난소 근처의 소량의 지방 조직을 제거합니다. 동물이 의식을 회복할 때까지 관찰하십시오. 수술 후 동물은 완전히 회복될 때까지 별도의 케이지에 넣으십시오.
7. 감염을 예방하려면 수술 후 3일 동안 쥐에게 겐타마이신을 투여하십시오. 수술 후에는 생쥐의 실제 상태에 따라 정상적인 식단과 양호한 성장 환경을 확보하십시오. 상처 감염이나 식욕 부진 등 이상이 있는 경우에는 즉시 실험동물센터의 강사에게 상담하십시오.

14. 약물 투여

참고: Pharmacology Experimental Methodology²⁶에 따르면, 사용된 인간 및 동물 투여량의 전환은 70kg 성인의 경우 9g의 Xiaoyao 알약으로, 1회 투여량(1회 투여에 대한 투여량)에 해당합니다.

1. 저용량 및 고용량 그룹의 경우 8마리 그룹에 대해 각각 0.683g/kg 및 2.73g/kg을 사용합니다. 왼손을 사용하여 쥐의 입이 식도와 일직선이 되도록 쥐를 고정시킵니다. 오른손에 gavage 바늘을 잡고 쥐의 입 모서리에서 인두 후벽을 따라 식도에 부드럽게 삽입합니다.
2. 이 시점에서, 개비젼 바늘의 방향은 유도된 삼킴 작용을 자극하기 위해 약간 변경될 수 있습니다. 약물을 주사합니다. 12주 동안 하루에 한 번씩 이 운동을 하십시오.
3. 가짜 운영 및 모델 그룹의 경우 12주 동안 하루에 한 번 동물의 체중에 따라 결정된 양으로 식염수를 투여합니다.
4. 자궁 경부 탈구로 쥐를 안락사시키고 뒷다리를 자릅니다. 팔다리를 피부를 벗겨 대퇴골에서 근육을 분리합니다. 생쥐 대퇴골을 EDTA 석회질 제거 용액으로 1개월 동안 치료하고 매일 새 용액으로 교체합니다.

15. Hematoxylin-eosin 염색(HE) 염색

1. 8분 동안 대퇴 조직을 왁스를 제거한 다음 3분 동안 그라디언트 에탄올에 넣습니다. 흐르는 물로 1분 동안 헹굽니다.
2. 헤마톡실린 염색 용액을 절편에 한 방울 떨어뜨려 조직을 완전히 덮고 5분 동안 염색한 후 수돗물로 세척합니다.
3. 슬라이드의 조직에 염산 분화 용액을 추가하여 조직을 완전히 덮도록 합니다. 조직의 변색이 관찰되면 중지하십시오. 수돗물로 헹굽니다.
4. Eosin 염료 용액을 적가하고 조직을 완전히 덮을 수 있도록 하고 30초에서 2분 동안 작용합니다. 여분의 염료를 흐르는 물로 헹굽니다.
5. 75% 무수 에탄올로 5분 동안 그래디언트 에탄올 탈수를 수행한 다음 5분 동안 무수 에탄올을 사용하고 3분 동안 탈랍 용액을 사용하여 청소합니다.
6. 티슈의 크기에 따라 슬라이드에 적당량의 중성 껌을 떨어뜨리고 기포를 피하면서 커버슬립을 조심스럽게 내립니다.

16. Micro-CT 및 면역조직화학 분석

1. 다른 그룹의 마우스에서 대퇴골 표본 주변의 과도한 근육과 인대를 제거하고 샘플 조직을 4% 파라포름알데히드로 24시간 동안 고정합니다.
2. 뼈 조직을 공기 건조시키고 뼈 조직 스캔을 통해 micro-CT를 수행하여 3차원 micro-CT 데이터를 얻습니다.
3. 보존된 마우스 왁스 블록에서 6μm 두께의 연속 섹션으로 자르고 조각을 70°C -72°C에서 30-60분 동안 굽습니다.
4. 8분 동안 왁스를 제거한 다음 75% 무수 에탄올 처리를 5분, 무수 에탄올을 5분 동안 처리하고 PBS 헹굼을 5분 동안 3회 헹굼합니다.
5. EDTA 고압 세척을 15분 동안 수행한 다음 PBS 세척을 5분 동안 3회 세척합니다.
6. 3% 과산화수소를 조직에 적액 적액하고 실온에서 10분 동안 배양한 다음 PBS로 5분 동안 3배 세척합니다.
7. 면역조직화학 펜을 사용하여 원을 그립니다. PBS 워시로 3분 동안 3분 동안 세탁합니다.
8. 1차 항체(항-ALP rabbit pAb(1:200), anti-COL-1 rabbit pAb(1:200), anti-IL-17 rabbit pAb(1:275), anti-Act1(1:500), anti-IL-6 rabbit pAb(1:500))를 밤새 염색한 후 PBS 완충액을 5분 동안 3회 헹굽니다.
9. 2차 항체(HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L; 1:2000))를 적가하고 실온에서 60분 동안 배양합니다. PBS 버퍼로 3분 동안 3회 세척합니다.
10. 바로 사용할 수 있는 DAB에서 3-5분 동안 배양한 다음 PBS로 헹굽니다.
11. 3분 동안 Hematoxylin 재염색을 수행한 다음 PBS 헹굼을 수행합니다.
12. 분화 용액을 약 10초 동안 사용한 다음 PBS 헹굼합니다.
13. 반환 파란색 용액을 10초 동안 넣은 다음 PBS 헹굼을 합니다.
14. 75% 무수 에탄올 처리를 5분 동안, 무수 에탄올을 5분 동안 수행하고, 3분 동안 투명합니다. 슬라이드를 밀봉하기 위해 중성 수지를 사용하십시오.

결과

활성 성분 및 Xiaoyao 알약의 작용 대상
TCMSP 데이터베이스를 검색하고 경구용 생체이용률(OB) ≥ 30% 및 약물 유사 특성(DL) ≥ 0.18 기준에 따라 스크리닝한 결과, 샤오야오 알약에 125가지 활성 성분이 존재하는 것으로 밝혀졌습니다. 그 중 성분 6, 4, 9, 13, 2, 6, 83 및 2는 각각 White Paeonia lactiflora, Atractylodes macrocephala, Menthae herba, Chaihu, Angelica sinensis, Poria cocos,...

토론

통계에 따르면 골다공증은 미국에서 매년 150만 건의 골절을 일으키며, 이 중 대다수는 폐경 후 여성에게 발생한다²⁷. 고령 인구가 증가함에 따라 향후 전 세계 고관절 골절의 대다수가 아시아에서 발생할 것으로 예측되며, 2050년에는 전 세계적으로 총 820만 명에 이를 것으로 예상됩니다²⁸. 골절을 예방하는 데 드는 비용은 골절을 치료하는 비용과 거의 같으며, ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1ml Sampler	Guangxi Beilunhe Medical Industrial Group Co.	JYQ001	For anesthesia in mice
4%polyformaldehyde	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P1110	For tissue fixation
6-0 absorbable suture (angled needle)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co.	HZX-06	For postoperative suturing
Absorbent cotton ball	Winner	MIANQIU-500g	For sterilization and hemostasis
Adhesive slides	Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co.	188105	For tissue sectioning
Amobarbital	Sigma Aldrich (Shanghai) Trading Co.	A-020-1ML	For anesthesia in mice
Bluing Solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1866	Blue coloration of the nuclei of cells after the action of hematoxylin differentiation solution
C57BL/6 mice	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	(SCXK 2033-0063)	For use in animal experiments
Carbon steel surgical blades	Premier Medical Equipment Co.	SP239	For mouse surgery
CIKS/TRAF3IP2 Rabbit pAb	BIOSS ANTIBODIES	bs-6202R	Binds to Act1 in tissues
Cole's Hematoxylin Solution (For Conventional Stain)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1140	For staining paraffin sections
Collagen Type I Polyclonal antibody	proteintech	14695-1-AP	Binds to COL-1 in tissues
DAB Substrate kit,20x	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	DA1010	For tissue color development
Disposable surgical sheet 50*60CM	Nanchang Xuhui Medical Equipment Co.	SP4529777	For mouse surgery
EDTA decalcification solution (pH 7.2)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	E1171-500ml	For tissue decalcification
Enhanced Endogenous Peroxidase Bloching Buffer	Beyotime Biotechnology	P0100B	Sequestration of tissue or cellular endogenous peroxidases
Environmentally friendly dewaxing clear liquid	Servicebio	G1128-1L	For dewaxing paraffin sections
Ethyl Alcohol	CHRON CHEMICALS	64-17-5 (CAS)	For dehydration of paraffin sections
General Purpose Antibody Diluent	Epizyme Biotech	PS119L	For antibody dilution
Hematoxylin Differentiation Solution	Servicebio	G1039-500ML	For differentiation after hematoxylin staining and removal of excessively bound and non-specifically adsorbed dye from tissues
Hematoxylin Eosin (HE) Staining Kit	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1120-3*100ml	For tissue staining
High quality stainless steel surgical knife handle	Premier Medical Equipment Co.	SP0088	For mouse surgery
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	proteintech	SA00001-2	Binds to primary antibody and amplifies signal
IL-17A Polyclonal antibody	proteintech	13082-1-AP	Binds to IL-17 in tissues
IL-6 Polyclonal antibody	proteintech	21865-1-AP	Binds to IL-6 in tissues
Immunohistochemistry pen	Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co.	ZLI-9305 (YA0310)	For drawing circles in immunohistochemistry
Medical surgical suture Non-absorbent (ball) 5-0 3.5m	Yangzhou Yuanlikang Medical Equipment Co.	FHX-5-2	For postoperative suturing
Medical Suture Needles Angle Needles 4*10 3/8	Chaohu Binxiong Medical Equipment Co.	FHZ612-4	For postoperative suturing
Neutral Balsam	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G8590	As a slice sealer
PBS(1X)	Shenzhen Mohong Technology Co.,Ltd	B0015	Buffer for slide washing and partial solution dilution
Protein Free Rapid Blocking Buffer (1X)	Epizyme Biotech	PS108P	Avoiding non-specific binding of proteins
Rabbit Anti-Bone Alkaline Phosphatase antibody	BIOSS ANTIBODIES	bs-6292R	Binds to alkaline phosphatase in tissues
Saline	Affiliated Hospital Youjiang Medical University For Nationalities	LHN500	For animals by gavage
Shaving/Electric clippers	HANGZHOU HUAYUAN PET PRODUCTS CO., LTD.	DTJ-002	For shaving mice
Stainless Steel Medical Needle Holder 14cm Coarse Needle	Premier Medical Equipment Co.	SP784	For mouse surgery
Stainless Steel Ophthalmic Forceps 10.5cm Curved (No Hook)	Zhuoyouyue	YKNWW-10.5	For mouse surgery
Stainless Steel Ophthalmic Scissors/Surgical Scissors 10CM Straight Tip	Premier Medical Equipment Co.	ZYJD-10-ZJ	For mouse surgery
Stainless Steel Tip Gastric Needle 12 Gauge 55mm Elbow		GWJ-12-55W	For use in mice by gavage
Tris-EDTA Antigen Repair Fluid (50x)	proteintech	PR30002	For antigen repair of paraffin sections
Wooden dissecting board 25*16cm		JP16*24	For mouse surgery
Xiaoyao pills	Jiuzhitang Co.,Ltd.	YPG-041	For animal drug delivery
Others
R 4.3.1			Data processing
Cytoscape3.9.1	National Resource for Network Biology		Building a regulatory network for traditional Chinese medicine
ImageJ 1.54f	National Institutes of Health		Image processing for immunohistochemistry results
Adobe Photoshop 24.0.0	Adobe		For image combination
GraphpadPrism 9.5	GraphPad Software		Statistical analysis of data
cellsens Dimension	OLYMPUS		For slicing and photographing
OLYMPUS BX53	OLYMPUS		For HE staining and immunohistochemical section photography