تحديد استقرار مصل إنزيم الأدينوزين 1 البشري

Summary

في هذه المقالة ، نوضح بالتفصيل طرقا لتوصيف قدرة الإنزيم على الاحتفاظ بالوظيفة عند تحضينه عند 37 درجة مئوية في المصل البشري ، وهي خاصية دوائية يشار إليها باسم استقرار المصل. قد تكون هذه القدرة عاملا رئيسيا في التنبؤ بملف الحركة الدوائية للإنزيم ومدى ملاءمته للاستخدام العلاجي.

Abstract

يستخدم مفهوم استقرار الإنزيم عادة للإشارة إلى الثبات الحراري للإنزيم - قدرته على الاحتفاظ بالبنية والنشاط مع زيادة درجة الحرارة. بالنسبة للإنزيم العلاجي ، قد تكون مقاييس الاستقرار الأخرى حاسمة أيضا ، لا سيما قدرته على الاحتفاظ بالوظيفة في المصل البشري عند 37 درجة مئوية ، والتي نشير إليها باسم استقرار المصل. هنا ، نصف مقايسة في المختبر لتقييم استقرار مصل إنزيم Homo sapiens adenosine deaminase I (HsADA1) من النوع البري باستخدام إجراء صفيحة دقيقة قائم على الامتصاص. على وجه التحديد ، تصف هذه المخطوطة تحضير المخازن المؤقتة والكواشف ، وهي طريقة لترتيب تكاثر HsADA1 في المصل ، وطريقة لتحليل عينات الاختبار باستخدام قارئ صفيحة دقيقة ، وتحليل مصاحب لتحديد جزء النشاط الذي يحتفظ به إنزيم HsADA1 في المصل كدالة للوقت. نناقش كذلك اعتبارات تكييف هذا البروتوكول مع الإنزيمات الأخرى ، باستخدام مثال على إنزيم Homo sapiens kynureninase ، للمساعدة في تكيف البروتوكول مع الإنزيمات الأخرى حيث يكون استقرار المصل ذا أهمية.

Introduction

الطريقة التالية تسمح للمستخدم بتقييم قدرة الإنزيم على الاحتفاظ بنشاطه كميا عند تعرضه لظروف تحاكي ما سيواجهه بعد الحقن في الوريد. تحاكي طريقة المختبر مثل هذه الظروف في الجسم الحي وتتكون من حضانة الإنزيم في مصل بشري مجمع عند 37 درجة مئوية وتحليلات متمتصلة للاحتفاظ بنشاط الإنزيم. نشير إلى قدرة الإنزيم على الاحتفاظ بالنشاط في هذه الظروف على أنها استقرار المصل ، وتستفيد طريقة تحليل نشاط الإنزيم من الاختلافات في الامتصاص بين ركيزة الإنزيم والمنتج الناتج. مفهوم استقرار المصل ليس فقط خاصا بالإنزيم وقد تم تطبيقه على العديد من طرق العلاج الأخرى أيضا. على سبيل المثال ، تم تقييم استقرار مصل مقبضات الحمض النووي الريبي التي تستهدف....

Protocol

1. حضانة المصل

1. قم بإعداد مخزون 10x من HsADA1 في 1x PBS pH 7.4 (1x PBS) بتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر. قم بإذابة 15 مل من المصل البشري المجمع وتسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية. قم بتسخين 50 مل من 1x PBS إلى 37 درجة مئوية.
2. تحضير مخاليط حضانة الإنزيم والمصل عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من مخزون 10x HsADA1 إلى 900 ميكرولتر من المصل البشري المجمع في أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض الارتباط ، يشار إليه باسم خليط الإنزيم + المصل. في أنبوب منفصل منخفض الارتباط لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة ، أضف 100 ميكرولتر من مخزون 10x HsADA1 إلى 900 ميكرولتر من 1x PBS للمقارنة مع عنصر تحكم غير مصلي ، يشار إليه باسم خليط الإنزيم ....

النتائج

توضح الأشكال نتائج تشغيل الفحص عند إجراؤها باستخدام النوع البري HsADA1. يوضح الشكل 3 أ ، ب منحنيات انخفاض الامتصاص عند 260 نانومتر من العينات التي نشأت من 1x PBS / مخاليط إنزيم مصل للنوع البري HsADA1 بعد إضافة الأدينوزين. هذا الامتصاص المتناقص كدالة لبيانا?.......

Discussion

يستخدم هذا البروتوكول تغيير الامتصاص حيث يتم تحويل الركيزة إلى المنتج لقياس نشاط الإنزيم. على هذا النحو ، يجب أن يكون للركيزة والمنتج ملامح طيفية مميزة. هذا هو الحال مع الأدينوزين والإينوزين اللذين لهما ملامح طيفية مميزة ومعاملات انقراض بين 260-265 نانومتر^6.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine	Sigma Aldrich	A9251-25G	25 g
BioTek Synergy HT Microplate Reader
Eppendorf LoBind Microcentrifuge Tubes: Protein	Fisher Scientific	13-698-795	2 mL
Glycerol	Fisher Scientific	G33-4	4 L
HsKYNase66-W102H-T333N	In-house
Human Serum, Pooled	MP Biomedicals	92931149	100 mL
Hydroxy-kynurenine	Cayman Chemicals	27778
Inosine	TCI	I0037	25 g
PBS, 1x  pH 7.4+/- 0.1	Corning	21-040-CM
Pyridoxal 5-phosphate monohydrate, 99%	Thermo Scientifc	228170010	1 g
UV-STAR MICROPLATE, 96 WELL, COC, F-BOTTOM	Greiner Bio	655801
Wildtype Human Adenosine Deaminase 1	In-house