인간 아데노신 데아미나제 1 효소의 혈청 안정성 측정

요약

이 기사에서는 인간 혈청에서 37°C에서 배양할 때 효소의 기능을 유지하는 능력(혈청 안정성이라고 하는 약리학적 특성)을 특성화하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 이 능력은 효소의 약동학 프로필과 치료 사용에 대한 적합성을 예측하는 데 중요한 요소가 될 수 있습니다.

초록

효소 안정성의 개념은 일반적으로 효소의 열 안정성, 즉 온도가 증가함에 따라 구조와 활성을 유지하는 능력을 나타내는 데 사용됩니다. 치료용 효소의 경우 다른 안정성 측정도 중요할 수 있으며, 특히 37°C에서 인간 혈청에서 기능을 유지하는 능력(혈청 안정성이라고 함)도 중요합니다. 여기에서는 흡광도 기반 마이크로플레이트 절차를 사용하여 야생형 Homo sapiens adenosine deaminase I(HsADA1) 효소의 혈청 안정성을 평가하기 위한 in vitro assay에 대해 설명합니다. 구체적으로, 이 원고는 완충액 및 시약의 준비, 혈청 내 HsADA1의 코인배양을 준비하는 방법, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 테스트 샘플을 분석하는 방법, HsADA1 효소가 시간의 함수로 혈청에 유지하는 활성률을 결정하기 위한 동반 분석을 설명합니다. 또한 호모 사피엔스 키누레니나아제 효소의 예를 들어 이 프로토콜을 다른 효소에 적용하기 위한 고려 사항에 대해 논의하여 혈청 안정성이 중요한 다른 효소에 대한 프로토콜의 적응을 돕습니다.

서문

다음 방법을 통해 사용자는 정맥 주사 후 발생할 상황을 모방한 조건에 노출될 때 효소의 활성을 유지하는 효소의 능력을 정량적으로 평가할 수 있습니다. in vitro 분석법은 이러한 in vivo 조건을 모방하며 37°C에서 통합된 인간 혈청에서 효소를 배양하고 효소 활성의 머무름에 대한 시간 경과 분석으로 구성됩니다. 이러한 조건에서 활성을 유지하는 효소의 능력을 혈청 안정성이라고 하며, 효소 활성에 대한 분석 방법은 효소의 기질과 결과 산물 간의 흡광도 차이를 이용합니다. 혈청 안정성의 개념은 효소 특이적일 뿐만 아니라 여러 다른 치료 방식에도 적용되었습니다. 예를 들어, COVID 스파이크 단백질을 표적으로 하는 RNA 압타머의 혈청 안정성은 이전에 태아 송아지 혈청¹로 배양 후 분해를 모니터링하여 평가되었습니다. 항균 펩타이드는 또한 풀링된 인간 혈청을 사용하여 배양 후 박테리아 성장을 억제하는 능력에 대해 평가되었습니다².

HsADA1은 아데노신 또는 2-데옥시아데노신이 각각 이노신 또는 2-데옥시이노신으로 전환되는 것을 촉매하는 효소^입니다3. 아데노신은 260nm의 흡수 피크를 갖는 반면, 이노신은 250nm에서 가장 강하게 흡수합니다⁴. 이러한 흡수 피크의 변화는 HsADA1이 아데노신에 추가될 때 260nm에서 흡수 강도의 감소에 의해 마이크로플레이트 리더에서 감지될 수 있습니다. HsADA1 효소는 인체에 중요한 영향을 미치며, 결핍은 심각한 복합 면역결핍(ADA-SCID^)을 유발합니다5. HsADA1의 소 상동체인 BtADA1은 ADA-SCID의 치료를 위한 효소 대체 치료제로 활용될 수 있으며, 이전에 야생형 HsADA1이 풀링된 인간 혈청과 함께 배양될 때 활성을 잃어 치료제로서의 사용을 방해할 수 있음을 보여주었습니다⁶. 따라서 효소의 혈청 안정성을 측정하는 절차를 시연하기 위해 야생형 HsADA1 효소를 선택했습니다. HsADA1에 대한 자세한 정제 방법은 앞서^{설명하였다 6}.

다음 프로토콜( 그림 1에 자세히 설명)에서는 37°C에서 통합된 인간 혈청에서 야생형 HsADA1을 공동 배양하는 방법을 보여줍니다. 이 기간 동안 테스트 샘플은 정의된 시점에서 채취되고 향후 분석을 위해 급속 동결됩니다. 모든 시료를 채취한 후에는 각 시료를 기질과 결합하는 마이크로플레이트 분석을 실행하며, 그 결과 흡광도 감소는 효소의 잔류 활성에 대한 상관 관계가 됩니다. HsADA1의 혈청 안정성을 보여주는 대표적인 결과가 제시되어 있으며, 이 지표는 다른 효소의 잠재적 치료 가치를 결정하는 데 관련이 있을 수 있기 때문에 이 프로토콜을 조작된 Homo sapiens kynureninase 효소(HsKYNase) 및 보다 일반적으로 모든 효소에 적용하기 위한 고려 사항도 논의합니다. HsKYNase는 트립토판의 대사에 관여하는 효소로 트립토판 부산물인 키누레닌과 하이드록시키누레닌(OH-Kyn)을 각각 안트라닐산과 하이드록시-안트라닐산(OH-AA)으로 분해할 수 있습니다. 트립토판 대사의 효소 매개 조절은 치료적 타당성이 있을 수 있다⁷.

프로토콜

1. 혈청 배양

1. 최종 농도 10μM에서 1x PBS pH 7.4(1x PBS)로 HsADA1 10x 스톡을 준비합니다. 풀링된 인간 혈청 15mL 분취액을 해동하고 37°C로 사전 데웁니다. 1x PBS의 50mL 부분 표본을 37°C로 예열합니다.
2. 효소 + 혈청 혼합물이라고 하는 저결합 미세 원심분리 튜브에 10x HsADA1 스톡 100μL를 900μL의 합동 인간 혈청에 첨가하여 효소-혈청 배양 혼합물을 준비합니다. 별도의 저결합 마이크로 원심분리기 튜브에 10x HsADA1 스톡 100μL를 1x PBS 900μL에 추가하여 효소 + 1x PBS 혼합물이라고 하는 비혈청 대조군과 비교합니다. 각 혼합물에서 HsADA1의 최종 농도는 1μM입니다.
3. 100μL의 1x PBS와 900μL의 풀링된 인간 혈청으로 구성된 저결합 마이크로 원심분리기 튜브에 추가 대조군을 준비합니다. 이것은 효소 + 혈청 혼합물에 대한 비효소 조절 역할을 합니다. 또한 1mL의 1x PBS로 구성된 대조군을 만드십시오. 이것은 효소 + 1x PBS 혼합물에 대한 비효소 제어 역할을 합니다.
4. 1.2단계에서 각 혼합물 100μL를 별도의 저결합 튜브에 분취하고 1x PBS에서 30%(v/v) 글리세롤 100μL로 1:1로 희석합니다. 액체 질소로 급속 냉동하고 -80 °C에서 보관합니다. 이 샘플은 Day 0 시점이 되며 해당 샘플의 HsADA1 농도는 500nM입니다. 1.3의 비효소 제어 혼합물에 대해 이 단계를 반복합니다. 모든 효소와 대조군 혼합물을 투명 필름으로 밀봉하고 37°C 인큐베이터에 넣습니다.
5. 24시간 후, 배양된 각 샘플의 100μL를 분취액하고 1x PBS에서 30%(v/v) 글리세롤 100μL로 1:1로 희석합니다. 액체 질소로 급속 냉동하고 -80 °C에서 보관합니다. 이 샘플은 1일차 시점입니다. 모든 효소 및 대조군 혼합물을 37°C 인큐베이터로 되돌립니다. 72시간 및 120시간에서 이 단계를 반복합니다.
   참고: Aliquoted 샘플이 반드시 급속 동결될 필요는 없습니다. 또는 사용자는 각 샘플을 채취한 직후 마이크로플레이트 기반 분석을 수행할 수 있지만, 샘플을 테스트할 때마다 새로운 표준 곡선과 아데노신 기질 스톡을 준비해야 합니다.

2. 마이크로플레이트 기반 분석

1. kinetic read 프로토콜(그림 2)을 설정하여 마이크로플레이트 리더를 준비하여 30분 동안 가장 짧은 판독 간격으로 260nm에서 흡광도를 측정하고 리더를 37°C의 설정값으로 예열합니다.
2. 수집된 모든 샘플을 얼음에서 해동합니다. 37°C로 사전 예열된 1x PBS를 저결합 마이크로 원심분리 튜브에서 희석제로 사용하여 해동된 각 샘플을 1:10으로 희석합니다. 이 샘플의 새로운 HsADA1 농도는 50nM입니다.
3. 비효소 혈청 대조군 샘플에서도 10x PBS로 희석합니다. 또한 50mL의 1x PBS에 66.8mg의 아데노신을 추가하여 5mM 아데노신 스톡을 준비합니다. 1x PBS 7,600 μL에 아데노신 스톡 400 μL를 첨가하여 아데노신 250 μM 희석액을 준비하고 인큐베이터에서 37 °C로 예열합니다.
4. 96웰 UV 호환 마이크로플레이트에 250μM 아데노신 희석액 160μL와 각 희석된 단백질 시료 40μL를 삼중으로 추가하여 총 부피 200μL를 만듭니다. 이것은 200 μM의 최종 아데노신 농도와 10 nM의 최종 효소 농도를 생성합니다.
5. 희석된 혈청 또는 1x PBS 대조군 40μL와 250μM 아데노신 희석액 160μL를 삼중으로 추가하여 대조군 샘플에 대한 희석을 반복합니다. 이것은 또한 200 μM의 최종 아데노신 농도를 생성하지만 효소는 없습니다.
   참고: 먼저 모든 희석된 효소 및 대조군 샘플을 마이크로플레이트에 개별적으로 추가한 다음 12채널 마이크로피펫으로 아데노신 기질을 추가하여 총 로딩 시간을 줄이는 것이 도움이 될 수 있습니다. 또한 이 단계에서는 플레이트 자체가 측정된 흡광도 신호를 혼동하지 않도록 UV 투명 플레이트를 사용해야 합니다.
6. 37°C에서 30분 동안 260nm에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다. 완료되면 추가 분석을 위해 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.

3. 마이크로플레이트 리더 데이터 분석

1. 흡광도 데이터의 선형 영역의 기울기를 마이크로플레이트 데이터의 처음 몇 분 동안의 시간 함수로 결정합니다. 혈청으로 희석된 샘플의 경우, 이는 처음 ~120초에 해당합니다. 1x PBS 희석 샘플의 경우 이는 처음 ~ 270 초에 해당합니다. 이 흡광도 값 감소의 기울기는 음의 숫자 값을 가지며 초당 흡광도 단위(ΔA260/s)의 변화 단위를 갖습니다.
2. 효소 + 혈청 데이터의 기울기에서 풀링된 인간 혈청으로 구성된 음성 대조군의 기울기를 뺍니다. 1x PBS 대조군의 기울기를 빼서 효소 + 1x PBS 혼합물에 대해 동일한 작업을 수행합니다.
3. 수식 1을 사용하여 조정된 모든 기울기를 t=0h의 원래 기울기로 정규화하여 남아 있는 활동의 비율을 구합니다.
   방정식 1
4. 시간 대비 남은 활동의 비율을 표시합니다.

결과

그림은 야생형 HsADA1로 수행했을 때 실행된 분석 결과를 보여줍니다. 그림 3A,B는 아데노신 첨가 후 야생형 HsADA1에 대한 1x PBS/혈청-효소 혼합물에서 유래한 샘플의 260nm에서 흡광도 감소 곡선을 보여줍니다. 시간 데이터의 함수로 인한 이러한 흡광도 감소는 사용자가 마이크로플레이트 기반 분석을 성공적으로 완료했을 때 예상할 수 있는...

토론

이 프로토콜은 효소의 활성을 측정하기 위해 기질이 생성물로 전환될 때 흡광도 변화를 사용합니다. 따라서 기판과 제품은 뚜렷한 스펙트럼 프로파일을 가져야 합니다. 이것은 아데노신과 이노신이 모두 260-265 nm 6,8,12,13 사이의 뚜렷한 스펙트럼 프로필과 흡광 계수를 갖는 경우입니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine	Sigma Aldrich	A9251-25G	25 g
BioTek Synergy HT Microplate Reader
Eppendorf LoBind Microcentrifuge Tubes: Protein	Fisher Scientific	13-698-795	2 mL
Glycerol	Fisher Scientific	G33-4	4 L
HsKYNase66-W102H-T333N	In-house
Human Serum, Pooled	MP Biomedicals	92931149	100 mL
Hydroxy-kynurenine	Cayman Chemicals	27778
Inosine	TCI	I0037	25 g
PBS, 1x  pH 7.4+/- 0.1	Corning	21-040-CM
Pyridoxal 5-phosphate monohydrate, 99%	Thermo Scientifc	228170010	1 g
UV-STAR MICROPLATE, 96 WELL, COC, F-BOTTOM	Greiner Bio	655801
Wildtype Human Adenosine Deaminase 1	In-house