测定人腺苷脱氨酶 1 酶的血清稳定性

摘要

在本文中，我们详细介绍了表征酶在人血清中于 37 °C 孵育时保持功能能力的方法，这种药理学特性称为其血清稳定性。这种能力可能是预测酶的药代动力学特征及其治疗用途适用性的关键因素。

摘要

酶稳定性的概念通常用于指代酶的热稳定性，即随着温度升高而保持结构和活性的能力。对于治疗性酶，其他稳定性指标也可能至关重要，尤其是它在 37 °C 下保持人血清功能的能力，我们称之为血清稳定性。在这里，我们描述了一种 体外 测定法，以使用基于吸光度的微孔板程序评估野生型 Homo sapiens 腺苷脱氨酶 I （HsADA1） 酶的血清稳定性。具体来说，本手稿描述了缓冲液和试剂的制备、安排 HsADA1 在血清中共孵育的方法、使用酶标仪分析测试样品的方法，以及确定 HsADA1 酶在血清中保留的活性分数随时间变化的分析。我们进一步讨论了使该方案适应其他酶的考虑因素，使用 Homo sapiens 犬尿氨酸酶的例子，以帮助该方案适应对血清稳定性感兴趣的其他酶。

引言

以下方法允许用户定量评估酶在暴露于模拟静脉注射后会遇到的条件时保持其活性的能力。 体外 方法模拟了这种 体内 条件，包括在 37 °C 下在混合人血清中孵育酶和酶活性保留的时间进程分析。我们将酶在这些条件下保持活性的能力称为其血清稳定性，酶活性分析方法利用了酶底物与所得产物之间吸光度的差异。血清稳定性的概念不仅具有酶特异性，还已应用于其他几种治疗方式。例如，靶向 COVID 刺突蛋白的 RNA 适体的血清稳定性先前是通过监测它们与胎牛血清孵育后的降解来评估的¹。还评估了抗菌肽在与混合人血清孵育后抑制细菌生长的能力²。

HsADA1 是一种催化腺苷或 2-脱氧腺苷分别转化为肌苷或 2-脱氧肌苷的酶³。腺苷的吸收峰为 260 nm，而肌苷在 250 nm 处吸收最强⁴。当 HsADA1 添加到腺苷中时，可以通过 260 nm 处吸收强度的降低在酶标仪上检测到吸收峰的这种变化。HsADA1 酶在人体中具有重要意义，其缺陷会导致严重的联合免疫缺陷 （ADA-SCID）⁵。HsADA1 的牛同源物 BtADA1 可用作治疗 ADA-SCID 的酶替....

研究方案

1. 血清孵育

1. 在 1x PBS pH 7.4 （1x PBS） 中制备 10x HsADA1 储备液，终浓度为 10 μM。解冻 15 mL 等分试样的混合人血清，并将其预热至 37 °C。 将 50 mL 等分试样的 1x PBS 预热至 37 °C。
2. 通过在低结合微量离心管中将 100 μL 的 10x HsADA1 原液添加到 900 μL 混合的人血清中来制备酶-血清孵育混合物，称为酶 + 血清混合物。在单独的低结合微量离心管中，将 100 μL 的 10x HsADA1 原液添加到 900 μL 的 1x PBS 中，以与非血清对照（称为酶 + 1x PBS 混合物）进行比较。每种混合物中 HsADA1 的最终浓度为 1 μM。
3. 在低结合微量离心管中制备额外的对照，该离心管由 100 μL 1x PBS 和 900 μL 混合的人血清混合而成。这将用作酶 + 血清混合物的非酶对照。此外，制作由 1 mL 1x PBS 组成的对照。这将用作酶 + 1x PBS 混合物的非酶对照。
4. 将步骤 1.2 中的每种混合物 100 μL 分装到单独的低结合管中，并在 1x PBS 中用 100 μL 30% （v/v） 甘油以 1：1 稀释。用液氮速冻并储存在 -80 °C。 这些样品将是第 0 天的时间点，其中 HsADA1 的浓度为 500 nM。对....

讨论

该方案使用底物转化为产物时的吸光度变化来测量酶的活性。因此，衬底和产品必须具有不同的光谱图。腺苷和肌苷都具有不同的光谱图和消光系数，介于 260-265 nm^之间 6,8,12,13。该测定法的灵感来自以前的几项工作。例如，Kalackar 利用 265 nm 处的吸光度变化作为腺苷脱氨酶活?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine	Sigma Aldrich	A9251-25G	25 g
BioTek Synergy HT Microplate Reader
Eppendorf LoBind Microcentrifuge Tubes: Protein	Fisher Scientific	13-698-795	2 mL
Glycerol	Fisher Scientific	G33-4	4 L
HsKYNase66-W102H-T333N	In-house
Human Serum, Pooled	MP Biomedicals	92931149	100 mL
Hydroxy-kynurenine	Cayman Chemicals	27778
Inosine	TCI	I0037	25 g
PBS, 1x  pH 7.4+/- 0.1	Corning	21-040-CM
Pyridoxal 5-phosphate monohydrate, 99%	Thermo Scientifc	228170010	1 g
UV-STAR MICROPLATE, 96 WELL, COC, F-BOTTOM	Greiner Bio	655801
Wildtype Human Adenosine Deaminase 1	In-house