Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
В этой статье мы подробно описываем методы характеристики способности фермента сохранять функцию при инкубации при 37 °C в сыворотке крови человека, фармакологическое свойство, называемое его стабильностью в сыворотке. Эта способность может быть ключевым фактором в прогнозировании фармакокинетического профиля фермента и его пригодности для терапевтического использования.
Понятие стабильности фермента обычно используется для обозначения термостабильности фермента — его способности сохранять структуру и активность при повышении температуры. Для терапевтического фермента другие показатели стабильности также могут иметь решающее значение, в частности, его способность сохранять функцию в сыворотке крови человека при 37 °C, которую мы называем стабильностью сыворотки. В данной статье мы описываем анализ in vitro для оценки сывороточной стабильности фермента аденозиндезаминазы I (HsADA1) дикого типа Homo sapiens с использованием микропланшетной процедуры, основанной на абсорбции. В частности, в данной рукописи описывается приготовление буферов и реагентов, метод организации коинкубации HsADA1 в сыворотке, метод анализа тестовых образцов с помощью считывателя микропланшетов и сопутствующий анализ для определения доли активности, которую фермент HsADA1 сохраняет в сыворотке в зависимости от времени. Далее мы обсудим соображения по адаптации этого протокола к другим ферментам на примере фермента кинурениназы Homo sapiens , чтобы помочь адаптировать протокол к другим ферментам, где стабильность сыворотки представляет интерес.
Следующий метод позволяет пользователю количественно оценить способность фермента сохранять свою активность при воздействии условий, которые имитируют те, с которыми он столкнется после внутривенной инъекции. Метод in vitro имитирует такие условия in vivo и состоит из инкубации фермента в объединенной сыворотке крови человека при 37 °C и временного анализа сохранения активности фермента. Мы называем способность фермента сохранять активность в этих условиях стабильностью его сыворотки крови, а метод анализа активности фермента использует различия в абсорбции между субстратом фермента и полученным продуктом. Концепция ....
1. Инкубация сыворотки
На рисунках представлены результаты пробирного анализа при проведении с диким типом HsADA1. На рисунках 3A, B показаны кривые снижения абсорбции на длине волны 260 нм образцов, полученных из 1x PBS/сывороточно-ферментных смесей для HsADA1 дикого типа пос.......
В этом протоколе используется изменение абсорбции при преобразовании субстрата в продукт для измерения активности фермента. Таким образом, подложка и продукт должны иметь различные спектральные профили. Это относится к аденозину и инозину, которые имеют различные с.......
JB и MRJ являются изобретателями по патентам или патентным заявкам, связанным с ферментами аденозиндезаминазой и/или кинурениназа. У всех остальных авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения [1DP2CA280622-01] и финансированием Biolocity. Мы благодарим доктора Марию Дженнингс и Андреа Фокс за предоставление векторов экспрессии HsADA1 и HsKYNase.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adenosine | Sigma Aldrich | A9251-25G | 25 g |
BioTek Synergy HT Microplate Reader | |||
Eppendorf LoBind Microcentrifuge Tubes: Protein | Fisher Scientific | 13-698-795 | 2 mL |
Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | 4 L |
HsKYNase66-W102H-T333N | In-house | ||
Human Serum, Pooled | MP Biomedicals | 92931149 | 100 mL |
Hydroxy-kynurenine | Cayman Chemicals | 27778 | |
Inosine | TCI | I0037 | 25 g |
PBS, 1x pH 7.4+/- 0.1 | Corning | 21-040-CM | |
Pyridoxal 5-phosphate monohydrate, 99% | Thermo Scientifc | 228170010 | 1 g |
UV-STAR MICROPLATE, 96 WELL, COC, F-BOTTOM | Greiner Bio | 655801 | |
Wildtype Human Adenosine Deaminase 1 | In-house |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены