Определение сывороточной стабильности фермента аденозиндезаминазы 1 человека

Резюме

В этой статье мы подробно описываем методы характеристики способности фермента сохранять функцию при инкубации при 37 °C в сыворотке крови человека, фармакологическое свойство, называемое его стабильностью в сыворотке. Эта способность может быть ключевым фактором в прогнозировании фармакокинетического профиля фермента и его пригодности для терапевтического использования.

Аннотация

Понятие стабильности фермента обычно используется для обозначения термостабильности фермента — его способности сохранять структуру и активность при повышении температуры. Для терапевтического фермента другие показатели стабильности также могут иметь решающее значение, в частности, его способность сохранять функцию в сыворотке крови человека при 37 °C, которую мы называем стабильностью сыворотки. В данной статье мы описываем анализ in vitro для оценки сывороточной стабильности фермента аденозиндезаминазы I (HsADA1) дикого типа Homo sapiens с использованием микропланшетной процедуры, основанной на абсорбции. В частности, в данной рукописи описывается приготовление буферов и реагентов, метод организации коинкубации HsADA1 в сыворотке, метод анализа тестовых образцов с помощью считывателя микропланшетов и сопутствующий анализ для определения доли активности, которую фермент HsADA1 сохраняет в сыворотке в зависимости от времени. Далее мы обсудим соображения по адаптации этого протокола к другим ферментам на примере фермента кинурениназы Homo sapiens , чтобы помочь адаптировать протокол к другим ферментам, где стабильность сыворотки представляет интерес.

Введение

Следующий метод позволяет пользователю количественно оценить способность фермента сохранять свою активность при воздействии условий, которые имитируют те, с которыми он столкнется после внутривенной инъекции. Метод in vitro имитирует такие условия in vivo и состоит из инкубации фермента в объединенной сыворотке крови человека при 37 °C и временного анализа сохранения активности фермента. Мы называем способность фермента сохранять активность в этих условиях стабильностью его сыворотки крови, а метод анализа активности фермента использует различия в абсорбции между субстратом фермента и полученным продуктом. Концепция ....

протокол

1. Инкубация сыворотки

1. Приготовьте 10-кратный запас HsADA1 в 1x PBS pH 7,4 (1x PBS) при конечной концентрации 10 мкМ. Разморозьте 15 мл аликвоты объединенной человеческой сыворотки и предварительно нагрейте ее до 37 °C. Разогрейте 50 мл аликвоты 1x PBS до 37 °C.
2. Приготовьте инкубационные смеси ферментов и сыворотки, добавив 100 мкл 10x запаса HsADA1 к 900 мкл объединенной человеческой сыворотки в микроцентрифужной пробирке с низким уровнем связывания, называемой смесью фермент + сыворотка. В отдельную микроцентрифужную пробирку с низким уровнем связывания добавьте 100 мкл 10x HsADA1 к 900 мкл 1x P....

Результаты

На рисунках представлены результаты пробирного анализа при проведении с диким типом HsADA1. На рисунках 3A, B показаны кривые снижения абсорбции на длине волны 260 нм образцов, полученных из 1x PBS/сывороточно-ферментных смесей для HsADA1 дикого типа пос.......

Обсуждение

В этом протоколе используется изменение абсорбции при преобразовании субстрата в продукт для измерения активности фермента. Таким образом, подложка и продукт должны иметь различные спектральные профили. Это относится к аденозину и инозину, которые имеют различные с.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine	Sigma Aldrich	A9251-25G	25 g
BioTek Synergy HT Microplate Reader
Eppendorf LoBind Microcentrifuge Tubes: Protein	Fisher Scientific	13-698-795	2 mL
Glycerol	Fisher Scientific	G33-4	4 L
HsKYNase66-W102H-T333N	In-house
Human Serum, Pooled	MP Biomedicals	92931149	100 mL
Hydroxy-kynurenine	Cayman Chemicals	27778
Inosine	TCI	I0037	25 g
PBS, 1x  pH 7.4+/- 0.1	Corning	21-040-CM
Pyridoxal 5-phosphate monohydrate, 99%	Thermo Scientifc	228170010	1 g
UV-STAR MICROPLATE, 96 WELL, COC, F-BOTTOM	Greiner Bio	655801
Wildtype Human Adenosine Deaminase 1	In-house