Определение сывороточной стабильности фермента аденозиндезаминазы 1 человека

Резюме

В этой статье мы подробно описываем методы характеристики способности фермента сохранять функцию при инкубации при 37 °C в сыворотке крови человека, фармакологическое свойство, называемое его стабильностью в сыворотке. Эта способность может быть ключевым фактором в прогнозировании фармакокинетического профиля фермента и его пригодности для терапевтического использования.

Аннотация

Понятие стабильности фермента обычно используется для обозначения термостабильности фермента — его способности сохранять структуру и активность при повышении температуры. Для терапевтического фермента другие показатели стабильности также могут иметь решающее значение, в частности, его способность сохранять функцию в сыворотке крови человека при 37 °C, которую мы называем стабильностью сыворотки. В данной статье мы описываем анализ in vitro для оценки сывороточной стабильности фермента аденозиндезаминазы I (HsADA1) дикого типа Homo sapiens с использованием микропланшетной процедуры, основанной на абсорбции. В частности, в данной рукописи описывается приготовление буферов и реагентов, метод организации коинкубации HsADA1 в сыворотке, метод анализа тестовых образцов с помощью считывателя микропланшетов и сопутствующий анализ для определения доли активности, которую фермент HsADA1 сохраняет в сыворотке в зависимости от времени. Далее мы обсудим соображения по адаптации этого протокола к другим ферментам на примере фермента кинурениназы Homo sapiens , чтобы помочь адаптировать протокол к другим ферментам, где стабильность сыворотки представляет интерес.

Введение

Следующий метод позволяет пользователю количественно оценить способность фермента сохранять свою активность при воздействии условий, которые имитируют те, с которыми он столкнется после внутривенной инъекции. Метод in vitro имитирует такие условия in vivo и состоит из инкубации фермента в объединенной сыворотке крови человека при 37 °C и временного анализа сохранения активности фермента. Мы называем способность фермента сохранять активность в этих условиях стабильностью его сыворотки крови, а метод анализа активности фермента использует различия в абсорбции между субстратом фермента и полученным продуктом. Концепция стабильности сыворотки является не только ферментоспецифичной, но и применяется к нескольким другим методам лечения. Например, сывороточная стабильность аптамеров РНК, нацеленных на шиповидные белки COVID, ранее оценивалась путем мониторинга их деградации после инкубации с сывороткой плода 1 телят^. Антибактериальные пептиды также были оценены на предмет их способности подавлять рост бактерий после инкубации с объединенной сывороткой 2^{человека.}

HsADA1 является ферментом, который катализирует превращение аденозина или 2-дезоксиаденозина в инозин или 2-дезоксиинозин,^{соответственно3.} Аденозин имеет пик поглощения 260 нм, в то время как инозин поглощается сильнее всего при 250^нм4. Этот сдвиг пиков поглощения может быть обнаружен на микропланшете по снижению интенсивности поглощения на длине волны 260 нм, когда HsADA1 добавляется к аденозину. Фермент HsADA1 имеет важное значение для организма человека, и его дефицит вызывает тяжелый комбинированный иммунодефицит (ADA-SCID)⁵. Бычий гомолог HsADA1, BtADA1, может быть использован в качестве ферментозаместительной терапии для лечения ADA-SCID, и ранее мы показали, что дикий тип HsADA1 теряет свою активность при инкубации с объединенной сывороткой человека, что потенциально препятствует его использованию в качестве терапевтического⁶. Поэтому мы выбрали фермент дикого типа HsADA1, чтобы продемонстрировать процедуру определения стабильности фермента в сыворотке крови. Подробный метод очистки HsADA1 был описан ранее⁶.

В следующем протоколе (как подробно описано на рисунке 1) мы демонстрируем, как проводить совместную инкубацию HsADA1 дикого типа в объединенной сыворотке крови человека при 37 °C. В течение этого времени отбираются тестовые образцы в определенные моменты времени и замораживаются для последующего анализа. После того, как все образцы были взяты, проводится анализ на микропланшетах, в ходе которого каждый образец объединяется с субстратом, при этом результирующее снижение абсорбции является корреляцией с сохраненной активностью фермента. Представлены репрезентативные результаты, иллюстрирующие сывороточную стабильность HsADA1, и, поскольку этот показатель может иметь отношение к определению потенциальной терапевтической ценности других ферментов, мы также обсуждаем соображения по адаптации этого протокола к модифицированному ферменту кинурениназе Homo sapiens (HsKYNase) и любым ферментам в более общем плане. HsKYNase является ферментом, участвующим в метаболизме триптофана и способным расщеплять побочные продукты триптофана кинуренин и гидрокси-кинуренин (OH-Kyn) в антраниловую кислоту и гидроксиантраниловую кислоту (OH-AA) соответственно. Фермент-опосредованная модуляция метаболизма триптофана может иметь терапевтическое значение⁷.

протокол

1. Инкубация сыворотки

1. Приготовьте 10-кратный запас HsADA1 в 1x PBS pH 7,4 (1x PBS) при конечной концентрации 10 мкМ. Разморозьте 15 мл аликвоты объединенной человеческой сыворотки и предварительно нагрейте ее до 37 °C. Разогрейте 50 мл аликвоты 1x PBS до 37 °C.
2. Приготовьте инкубационные смеси ферментов и сыворотки, добавив 100 мкл 10x запаса HsADA1 к 900 мкл объединенной человеческой сыворотки в микроцентрифужной пробирке с низким уровнем связывания, называемой смесью фермент + сыворотка. В отдельную микроцентрифужную пробирку с низким уровнем связывания добавьте 100 мкл 10x HsADA1 к 900 мкл 1x PBS для сравнения с несывороточным контролем, называемым смесью фермент + 1x PBS. Конечная концентрация HsADA1 в каждой смеси составит 1 мкМ.
3. Приготовьте дополнительный контроль в микроцентрифужной пробирке с низким уровнем связывания, состоящей из 100 мкл 1x PBS, смешанного с 900 мкл объединенной человеческой сыворотки. Это послужит неферментным контролем для смеси фермент + сыворотка. Дополнительно сделайте контроль, состоящий из 1 мл 1x PBS. Это будет служить в качестве неферментативного контроля для фермента + 1x PBS смеси.
4. Распределите 100 мкл каждой смеси с этапа 1.2 в отдельные пробирки с низким уровнем связывания и разбавьте 1:1 100 мкл 30% (v/v) глицерина в 1x PBS. Мгновенную заморозку жидким азотом и хранить при температуре -80 °C. Эти образцы будут иметь временную точку дня 0, а концентрация HsADA1 в них составит 500 нМ. Повторите этот шаг для смесей без ферментов из 1.3. Запечатайте все ферменты и контрольные смеси прозрачной пленкой и поместите их в инкубатор с температурой 37 °C.
5. Через 24 ч внесите 100 мкл каждого инкубированного образца и разбавьте 1:1 100 мкл 30% (v/v) глицерина в 1x PBS. Мгновенную заморозку жидким азотом и хранить при температуре -80 °C. Эти образцы будут временной точкой дня 1. Верните все ферментные и контрольные смеси в инкубатор при температуре 37 °C. Повторите этот шаг через 72 ч и 120 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Аликвотированные образцы не обязательно должны быть мгновенно заморожены. В качестве альтернативы пользователь может выполнить анализ на основе микропланшетов сразу после взятия каждого образца, хотя при каждом тестировании образца необходимо готовить свежие стандартные кривые и запасы аденозинового субстрата.

2. Анализ на микропланшетах

1. Подготовьте считыватель микропланшетов, настроив протокол кинетического считывания (рис. 2) для измерения поглощения при длине волны 260 нм с кратчайшим интервалом считывания в течение 30 мин и предварительно нагрейте считыватель до заданного значения 37 °C.
2. Разморозьте все собранные образцы на льду. Разбавьте каждый размороженный образец в соотношении 1:10 с использованием 1x PBS, предварительно нагретого до 37 °C, в качестве разбавителя в микроцентрифужных пробирках с низким уровнем связывания. Новая концентрация HsADA1 в этих образцах составит 50 нМ.
3. Также сделайте 10-кратное разведение до 1x PBS из контрольного образца сыворотки, не содержащего ферментов. Кроме того, приготовьте 5 мМ аденозина, добавив 66,8 мг аденозина к 50 мл 1x PBS. Приготовьте 250 μМ разведение аденозина, добавив 400 μL аденозинового запаса к 7 600 μL 1x PBS и предварительно подогрейте его до 37 °C в инкубаторе.
4. В 96-луночный УФ-совместимый микропланшет добавьте 160 мкл 250 мкМ разведения аденозина и 40 мкл каждого разведенного образца белка в трех экземплярах, чтобы получить общий объем 200 мкл. Это дает конечную концентрацию аденозина 200 мкМ и конечную концентрацию фермента 10 нМ.
5. Повторите разведение для контрольных образцов, добавив 40 мкл разбавленной сыворотки или 1x PBS контрольной группы и 160 мкл 250 мкМ аденозина в тройном разведении. Это также дает конечную концентрацию аденозина 200 мкМ, но без фермента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть полезно сначала добавить все разведенные ферменты и контрольные образцы по отдельности на микропланшет, а затем добавить аденозиновый субстрат с помощью 12-канальной микропипетки для сокращения общего времени загрузки. Кроме того, на этом этапе необходимо использовать УФ-прозрачные пластины, чтобы предотвратить искажение измеренного сигнала поглощения на самой пластине.
6. Измерьте поглощение каждой лунки при длине волны 260 нм в течение 30 минут при 37 °C. После этого экспортируйте данные в электронную таблицу для дальнейшего анализа.

3. Анализ данных считывателя микропланшетов

1. Определите наклон линейной области данных о поглощении в зависимости от времени для первых нескольких минут данных микропланшета. Для образцов, разбавленных сывороткой, это соответствовало первым ~120 с. Для 1x PBS-разбавленных образцов это соответствовало первым ~270 с. Этот наклон убывающих значений поглощения будет иметь отрицательное числовое значение и будет иметь единицы изменения в единицах поглощения в секунду (ΔA260/с).
2. Вычтите наклон отрицательного контроля, состоящего из объединенной сыворотки крови человека, из наклона данных фермента + сыворотки. Проделайте ту же операцию со смесью фермент + 1x PBS, вычитая наклон элемента управления 1x PBS.
3. Нормализуем все скорректированные уклоны до исходного уклона при t=0 ч, чтобы получить долю оставшейся активности, используя уравнение 1.
   Уравнение 1
4. Составьте график зависимости оставшейся активности от времени.

Результаты

На рисунках представлены результаты пробирного анализа при проведении с диким типом HsADA1. На рисунках 3A, B показаны кривые снижения абсорбции на длине волны 260 нм образцов, полученных из 1x PBS/сывороточно-ферментных смесей для HsADA1 дикого типа пос...

Обсуждение

В этом протоколе используется изменение абсорбции при преобразовании субстрата в продукт для измерения активности фермента. Таким образом, подложка и продукт должны иметь различные спектральные профили. Это относится к аденозину и инозину, которые имеют различные с...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine	Sigma Aldrich	A9251-25G	25 g
BioTek Synergy HT Microplate Reader
Eppendorf LoBind Microcentrifuge Tubes: Protein	Fisher Scientific	13-698-795	2 mL
Glycerol	Fisher Scientific	G33-4	4 L
HsKYNase66-W102H-T333N	In-house
Human Serum, Pooled	MP Biomedicals	92931149	100 mL
Hydroxy-kynurenine	Cayman Chemicals	27778
Inosine	TCI	I0037	25 g
PBS, 1x  pH 7.4+/- 0.1	Corning	21-040-CM
Pyridoxal 5-phosphate monohydrate, 99%	Thermo Scientifc	228170010	1 g
UV-STAR MICROPLATE, 96 WELL, COC, F-BOTTOM	Greiner Bio	655801
Wildtype Human Adenosine Deaminase 1	In-house