Détermination de la stabilité sérique de l’enzyme adénosine désaminase 1 humaine

Résumé

Dans cet article, nous détaillons des méthodes pour caractériser la capacité d’une enzyme à conserver sa fonction lorsqu’elle est incubée à 37 °C dans le sérum humain, une propriété pharmacologique appelée stabilité sérique. Cette capacité peut être un facteur clé dans la prédiction du profil pharmacocinétique d’une enzyme et de son aptitude à un usage thérapeutique.

Résumé

Le concept de stabilité enzymatique est généralement utilisé pour faire référence à la thermostabilité d’une enzyme, c’est-à-dire à sa capacité à conserver sa structure et son activité lorsque la température augmente. Pour une enzyme thérapeutique, d’autres mesures de stabilité peuvent également être critiques, en particulier sa capacité à conserver sa fonction dans le sérum humain à 37 °C, ce que nous appelons la stabilité sérique. Ici, nous décrivons un test in vitro pour évaluer la stabilité sérique de l’enzyme sauvage Homo sapiens adénosine désaminase I (HsADA1) à l’aide d’une procédure de microplaque basée sur l’absorbance. Plus précisément, ce manuscrit décrit la préparation de tampons et de réactifs, une méthode d’organisation de la coïncubation de HsADA1 dans le sérum, une méthode d’analyse des échantillons de test à l’aide d’un lecteur de microplaques et une analyse d’accompagnement pour déterminer la fraction d’activité qu’une enzyme HsADA1 conserve dans le sérum en fonction du temps. Nous discutons plus en détail des considérations visant à adapter ce protocole à d’autres enzymes, en utilisant l’exemple d’une enzyme kynurénase Homo sapiens , afin d’aider à l’adaptation du protocole à d’autres enzymes où la stabilité sérique est intéressante.

Introduction

La méthode suivante permet à un utilisateur d’évaluer quantitativement la capacité d’une enzyme à conserver son activité lorsqu’elle est exposée à des conditions qui imitent ce qu’elle rencontrera après une injection intraveineuse. La méthode in vitro imite de telles conditions in vivo et consiste en l’incubation de l’enzyme dans du sérum humain groupé à 37 °C et des analyses chronologiques de la rétention de l’activité enzymatique. Nous nous référons à la capacité d’une enzyme à conserver son activité dans ces conditions comme sa stabilité sérique, et la méthode d’analyse de l’activité enzymatique tire parti des dif....

Protocole

1. Incubation sérique

1. Préparez une quantité 10x de HsADA1 dans 1x PBS pH 7,4 (1x PBS) à une concentration finale de 10 μM. Décongelez une aliquote de 15 mL de sérum humain mélangé et préchauffez-la à 37 °C. Préchauffer une aliquote de 50 mL de 1x PBS à 37 °C.
2. Préparez les mélanges d’incubation enzyme-sérum en ajoutant 100 μL de la matrice 10x HsADA1 à 900 μL de sérum humain mélangé dans un tube de microcentrifugation à faible liaison, appelé mélange enzyme + sérum. Dans un tube de microcentrifugation séparé à faible liaison, ajoutez 100 μL de la matrice 10x HsADA1 à 900 μL de 1x PBS pour comparais....

Discussion

Ce protocole utilise le changement d’absorbance lorsque le substrat est converti en produit pour évaluer l’activité d’une enzyme. En tant que tels, le substrat et le produit doivent avoir des profils spectraux distincts. C’est le cas de l’adénosine et de l’inosine ayant toutes deux des profils spectraux distincts et des coefficients d’extinction compris entre 260 et 265 nm 6,8,12,13.^.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine	Sigma Aldrich	A9251-25G	25 g
BioTek Synergy HT Microplate Reader
Eppendorf LoBind Microcentrifuge Tubes: Protein	Fisher Scientific	13-698-795	2 mL
Glycerol	Fisher Scientific	G33-4	4 L
HsKYNase66-W102H-T333N	In-house
Human Serum, Pooled	MP Biomedicals	92931149	100 mL
Hydroxy-kynurenine	Cayman Chemicals	27778
Inosine	TCI	I0037	25 g
PBS, 1x  pH 7.4+/- 0.1	Corning	21-040-CM
Pyridoxal 5-phosphate monohydrate, 99%	Thermo Scientifc	228170010	1 g
UV-STAR MICROPLATE, 96 WELL, COC, F-BOTTOM	Greiner Bio	655801
Wildtype Human Adenosine Deaminase 1	In-house