Determinazione della stabilità sierica dell'enzima adenosina deaminasi 1 umana

Riepilogo

In questo articolo, descriviamo in dettaglio i metodi per caratterizzare la capacità di un enzima di mantenere la funzione quando incubato a 37 °C nel siero umano, una proprietà farmacologica indicata come stabilità del siero. Questa capacità può essere un fattore chiave nel prevedere il profilo farmacocinetico di un enzima e la sua idoneità per l'uso terapeutico.

Abstract

Il concetto di stabilità enzimatica è tipicamente usato per riferirsi alla termostabilità di un enzima, la sua capacità di mantenere la struttura e l'attività all'aumentare della temperatura. Per un enzima terapeutico, possono essere fondamentali anche altre misure di stabilità, in particolare la sua capacità di mantenere la funzione nel siero umano a 37 °C, che chiamiamo stabilità del siero. Qui, descriviamo un test in vitro per valutare la stabilità sierica dell'enzima wildtype Homo sapiens adenosina deaminasi I (HsADA1) utilizzando una procedura di micropiastra basata sull'assorbanza. In particolare, questo manoscritto descrive la preparazione di tamponi e reagenti, un metodo che organizza la coincubazione di HsADA1 nel siero, un metodo per analizzare i campioni di prova utilizzando un lettore di micropiastre e un'analisi di accompagnamento per determinare la frazione di attività che un enzima HsADA1 mantiene nel siero in funzione del tempo. Discutiamo inoltre le considerazioni per adattare questo protocollo ad altri enzimi, utilizzando un esempio di un enzima chinurenina Homo sapiens , per aiutare l'adattamento del protocollo ad altri enzimi in cui la stabilità sierica è di interesse.

Introduzione

Il seguente metodo consente a un utente di valutare quantitativamente la capacità di un enzima di mantenere la sua attività quando esposto a condizioni che imitano ciò che incontrerà dopo l'iniezione endovenosa. Il metodo in vitro imita tali condizioni in vivo e consiste nell'incubazione dell'enzima in un pool di siero umano a 37 °C e nell'analisi a tempo determinato della ritenzione dell'attività enzimatica. Ci riferiamo alla capacità di un enzima di mantenere l'attività in queste condizioni come stabilità del suo siero e il metodo di analisi per l'attività enzimatica sfrutta le differenze di assorbanza tra il subst....

Protocollo

1. Incubazione del siero

1. Preparare una dose 10x di HsADA1 in 1x PBS pH 7,4 (1x PBS) a una concentrazione finale di 10 μM. Scongelare un'aliquota di 15 mL di siero umano aggregato e preriscaldarla a 37 °C. Preriscaldare un'aliquota da 50 mL di 1x PBS a 37 °C.
2. Preparare le miscele di incubazione enzima-siero aggiungendo 100 μl del stock 10x HsADA1 a 900 μl di siero umano aggregato in una provetta da microcentrifuga a basso legame, denominata miscela enzima + siero. In una provetta da microcentrifuga separata a basso legame, aggiungere 100 μl del 10x HsADA1 stock a 900 μl di 1x PBS per il confronto c....

Discussione

Questo protocollo utilizza la variazione dell'assorbanza quando il substrato viene convertito nel prodotto per misurare l'attività di un enzima. Pertanto, il substrato e il prodotto devono avere profili spettrali distinti. Questo è il caso dell'adenosina e dell'inosina, entrambe con profili spettrali distinti e coefficienti di estinzione compresi tra 260-265 nm 6,8,12,13.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine	Sigma Aldrich	A9251-25G	25 g
BioTek Synergy HT Microplate Reader
Eppendorf LoBind Microcentrifuge Tubes: Protein	Fisher Scientific	13-698-795	2 mL
Glycerol	Fisher Scientific	G33-4	4 L
HsKYNase66-W102H-T333N	In-house
Human Serum, Pooled	MP Biomedicals	92931149	100 mL
Hydroxy-kynurenine	Cayman Chemicals	27778
Inosine	TCI	I0037	25 g
PBS, 1x  pH 7.4+/- 0.1	Corning	21-040-CM
Pyridoxal 5-phosphate monohydrate, 99%	Thermo Scientifc	228170010	1 g
UV-STAR MICROPLATE, 96 WELL, COC, F-BOTTOM	Greiner Bio	655801
Wildtype Human Adenosine Deaminase 1	In-house