ヒトアデノシンデアミナーゼ1酵素の血清安定性の測定

要約

この記事では、ヒト血清中で37°Cでインキュベートした場合の酵素の機能保持能力(血清安定性と呼ばれる薬理学的特性)を特徴付ける方法について詳しく説明します。この能力は、酵素の薬物動態プロファイルと治療使用への適合性を予測する上で重要な要素となる可能性があります。

要約

酵素の安定性の概念は、通常、酵素の熱安定性、つまり温度が上昇しても構造と活性を保持する能力を指すために使用されます。治療用酵素の場合、安定性の他の尺度、特に37°Cでヒト血清中の機能を保持する能力(これを血清安定性と呼んでいます)も重要になる可能性があります。ここでは、吸光度ベースのマイクロプレート手順を使用して、野生型ホモ・サピエンス・アデノシン・デアミナーゼI(HsADA1)酵素の血清安定性を評価するためのin vitroアッセイについて説明します。具体的には、この原稿では、バッファーと試薬の調製、血清中のHsADA1の共インキュベーションの手配方法、マイクロプレートリーダーを使用して試験サンプルを分析する方法、およびHsADA1酵素が時間の関数として血清中に保持する活性の割合を決定するための付随する分析について説明します。さらに、ホモ・サピエンス・キヌレニナーゼ酵素の例を使用して、このプロトコルを他の酵素に適応させるための考慮事項について議論し、血清の安定性が関心のある他の酵素へのプロトコルの適応を支援します。

概要

次の方法により、ユーザーは、静脈内注射後に遭遇するものを模倣する条件にさらされたときに、酵素がその活性を保持する能力を定量的に評価できます。 in vitro 法は、このような in vivo 条件を模倣し、37°Cでプールされたヒト血清中での酵素のインキュベーションと、酵素活性の保持の経時的な分析で構成されています。これらの条件下で活性を保持する酵素の能力を血清安定性と呼び、酵素活性の分析法では、酵素の基質と得られる生成物との間の吸光度の違いを利用しています。血清安定性の概念は酵素特異的なものではなく、他のいくつかの治療法にも適用されています。例えば、COVIDスパイクタンパク質を標的とするRNAアプタマーの血清安定性は、以前にウシ胎児血清¹とのインキュベーション後の分解をモニタリングすることで評価されてきました。抗菌ペプチドは、プールされたヒト血清²とのインキュベーション後に細菌の増殖を抑制する能力についても評価されています。

HsADA1は、アデノシンまたは2-デオキシアデノシンからイノシンまたは2-デオキシイノシンへの変換を触媒する酵素です^3。アデノシンの吸収ピークは260nmですが、イノシンは250nm4で最も強く吸収しま....

プロトコル

1. 血清インキュベーション

1. 最終濃度10 μMで1x PBS pH 7.4 (1x PBS)中のHsADA1の10倍ストックを調製し、プールしたヒト血清の15 mLアリコートを解凍し、37°Cに予熱します。 1x PBSの50 mLアリコートを37°Cに予温します。
2. 酵素+血清混合物と呼ばれる低結合微量遠心チューブで、10x HsADA1ストック100 μLをプールしたヒト血清900 μLを加えて、酵素-血清インキュベーション混合物を調製します。別の低結合微量遠心チューブで、10x HsADA1ストック100 μLを1x PBSストック900 μLに加えて、酵素+1x PBS混合物と呼ばれる非血清コントロールと比較します。各混合物中のHsADA1の最終濃度は1μMになります。
3. 100 μL の 1x PBS と 900 μL のプールされたヒト血清を混合した低結合マイクロ遠心チューブで、追加のコントロールを調製します。これは、酵素+血清混合物の非酵素制御として機能します。さらに、1 mLの1x PBSからなるコントロールを作成します。これは、酵素+ 1x PBS混合物の非酵素制御として機能します。
4. ステップ1.2の各混合物100 μLを別々の低結合チューブに分注し、1x PBSで30%(v / v)グリセロール100 μLで1:1に希釈します。液体窒....

ディスカッション

このプロトコルでは、基質が製品に変換される際の吸光度変化を使用して、酵素の活性を測定します。そのため、基板と製品は異なるスペクトルプロファイルを持つ必要があります。これは、アデノシンとイノシンの両方が異なるスペクトルプロファイルを持ち、吸光係数が260〜265 nmの場合です6,8,12,13。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine	Sigma Aldrich	A9251-25G	25 g
BioTek Synergy HT Microplate Reader
Eppendorf LoBind Microcentrifuge Tubes: Protein	Fisher Scientific	13-698-795	2 mL
Glycerol	Fisher Scientific	G33-4	4 L
HsKYNase66-W102H-T333N	In-house
Human Serum, Pooled	MP Biomedicals	92931149	100 mL
Hydroxy-kynurenine	Cayman Chemicals	27778
Inosine	TCI	I0037	25 g
PBS, 1x  pH 7.4+/- 0.1	Corning	21-040-CM
Pyridoxal 5-phosphate monohydrate, 99%	Thermo Scientifc	228170010	1 g
UV-STAR MICROPLATE, 96 WELL, COC, F-BOTTOM	Greiner Bio	655801
Wildtype Human Adenosine Deaminase 1	In-house