Bestimmung der Serumstabilität des humanen Adenosin-Desaminase-1-Enzyms

Zusammenfassung

In diesem Artikel beschreiben wir Methoden zur Charakterisierung der Fähigkeit eines Enzyms, seine Funktion beizubehalten, wenn es bei 37 °C in menschlichem Serum inkubiert wird, eine pharmakologische Eigenschaft, die als Serumstabilität bezeichnet wird. Diese Fähigkeit kann ein Schlüsselfaktor bei der Vorhersage des pharmakokinetischen Profils eines Enzyms und seiner Eignung für den therapeutischen Einsatz sein.

Zusammenfassung

Das Konzept der Enzymstabilität wird in der Regel verwendet, um sich auf die Thermostabilität eines Enzyms zu beziehen - seine Fähigkeit, Struktur und Aktivität bei steigender Temperatur beizubehalten. Für ein therapeutisches Enzym können auch andere Stabilitätsmaße entscheidend sein, insbesondere seine Fähigkeit, die Funktion im menschlichen Serum bei 37 °C beizubehalten, was wir als Serumstabilität bezeichnen. In dieser Arbeit beschreiben wir einen in vitro Assay zur Beurteilung der Serumstabilität des Wildtyp-Enzyms Homo sapiens Adenosin-Deaminase I (HsADA1) unter Verwendung eines absorptionsbasierten Mikroplattenverfahrens. Insbesondere beschreibt dieses Manuskript die Herstellung von Puffern und Reagenzien, ein Verfahren zur Anordnung der Koinkubation von HsADA1 im Serum, ein Verfahren zur Analyse der Testproben unter Verwendung eines Mikroplatten-Readers und eine begleitende Analyse zur Bestimmung des Anteils der Aktivität, den ein HsADA1-Enzym im Serum als Funktion der Zeit beibehält. Wir diskutieren ferner Überlegungen zur Anpassung dieses Protokolls an andere Enzyme, indem wir ein Beispiel eines Homo sapiens-Kynureninase-Enzyms verwenden, um die Anpassung des Protokolls an andere Enzyme zu unterstützen, bei denen die Serumstabilität von Interesse ist.

Einleitung

Die folgende Methode ermöglicht es einem Anwender, die Fähigkeit eines Enzyms, seine Aktivität aufrechtzuerhalten, quantitativ zu beurteilen, wenn es Bedingungen ausgesetzt wird, die dem entsprechen, was es nach einer intravenösen Injektion vorfinden wird. Die In-vitro-Methode ahmt solche in vivo-Bedingungen nach und besteht aus der Inkubation des Enzyms in gepooltem Humanserum bei 37 °C und zeitlichen Analysen der Beibehaltung der Enzymaktivität. Wir bezeichnen die Fähigkeit eines Enzyms, die Aktivität unter diesen Bedingungen aufrechtzuerhalten, als seine Serumstabilität, und die Analysemethode für die Enzymaktivit....

Protokoll

1. Inkubation im Serum

1. Bereiten Sie eine 10-fache Brühe HsADA1 in 1x PBS pH 7,4 (1x PBS) in einer Endkonzentration von 10 μM vor. Tauen Sie ein 15-ml-Aliquot des gepoolten Humanserums auf und erwärmen Sie es auf 37 °C. Erwärmen Sie ein 50 mL aliquot von 1x PBS auf 37 °C.
2. Bereiten Sie die Enzym-Serum-Inkubationsgemische vor, indem Sie 100 μl des 10x HsADA1-Stammes zu 900 μl gepooltem Humanserum in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung hinzufügen, das als Enzym + Serum-Mischung bezeichnet wird. Geben Sie in einem separaten Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung 100 μl des 10x Hs....

Diskussion

Dieses Protokoll verwendet die Absorptionsänderung, wenn das Substrat in das Produkt umgewandelt wird, um die Aktivität eines Enzyms zu messen. Daher müssen das Substrat und das Produkt unterschiedliche spektrale Profile aufweisen. Dies ist der Fall bei Adenosin und Inosin, die beide unterschiedliche spektrale Profile und Extinktionskoeffizienten zwischen 260-265 nm^aufweisen 6,8,12,13.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine	Sigma Aldrich	A9251-25G	25 g
BioTek Synergy HT Microplate Reader
Eppendorf LoBind Microcentrifuge Tubes: Protein	Fisher Scientific	13-698-795	2 mL
Glycerol	Fisher Scientific	G33-4	4 L
HsKYNase66-W102H-T333N	In-house
Human Serum, Pooled	MP Biomedicals	92931149	100 mL
Hydroxy-kynurenine	Cayman Chemicals	27778
Inosine	TCI	I0037	25 g
PBS, 1x  pH 7.4+/- 0.1	Corning	21-040-CM
Pyridoxal 5-phosphate monohydrate, 99%	Thermo Scientifc	228170010	1 g
UV-STAR MICROPLATE, 96 WELL, COC, F-BOTTOM	Greiner Bio	655801
Wildtype Human Adenosine Deaminase 1	In-house