تداخل الحمض النووي الريبي اليرقي في دودة القز Bombyx mori من خلال توصيل الجسيمات النانوية للشيتوسان / dsRNA

Summary

يتم تقديم بروتوكول لتوصيل الجسيمات النانوية للشيتوزان / dsRNA في يرقات دودة القز Bombyx mori للحث على إسكات الجينات من خلال الابتلاع.

Abstract

دودة القز ، بومبيكس موري ، هي حشرة اقتصادية مهمة لها آلاف السنين من التاريخ في الصين. وفي الوقت نفسه ، فإن دودة القز هي الحشرة النموذجية ل Lepidoptera مع تراكم جيد للأبحاث الأساسية. وهي أيضا أول حشرة في حرشفيات الأجنحة مع تسلسل الجينوم الكامل وتجميعه ، مما يوفر أساسا متينا للدراسة الوظيفية للجينات. على الرغم من أن تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) يستخدم على نطاق واسع في الدراسة الوظيفية للجينات العكسية ، إلا أنه مقاوم للحرارة في ديدان القز وأنواع حرشفيات الأجنحة الأخرى. تم إجراء أبحاث ناجحة سابقة متعلقة بالحمض النووي الريبي لتوصيل الحمض النووي الريبي المزدوج الشريطة (dsRNA) من خلال الحقن فقط. لا يتم الإبلاغ أبدا عن توصيل dsRNA من خلال التغذية. في هذه المقالة ، نصف الإجراءات خطوة بخطوة لتحضير الجسيمات النانوية للشيتوزان / dsRNA ، والتي يتم تغذيتها ليرقات دودة القز عن طريق الابتلاع. يتضمن البروتوكول (أنا) اختيار المرحلة المناسبة من يرقات دودة القز ، (ثانيا) تخليق dsRNA ، (ثالثا) تحضير جزيئات الشيتوزان / dsRNA النانوية ، و (رابعا) تغذية يرقات دودة القز بجسيمات شيتوزان / dsRNA النانوية. يتم تقديم نتائج تمثيلية ، بما في ذلك تأكيد النسخ الجيني ومراقبة النمط الظاهري. تغذية dsRNA هي تقنية بسيطة ل RNAi في يرقات دودة القز. نظرا لأن يرقات دودة القز سهلة التربية وكبيرة بما يكفي للعمل ، فإنها توفر نموذجا جيدا لإثبات الحمض النووي الريبي اليرقات في الحشرات. بالإضافة إلى ذلك ، تحفز بساطة هذه التقنية المزيد من مشاركة الطلاب في البحث ، مما يجعل يرقات دودة القز نظاما وراثيا مثاليا للاستخدام في الفصول الدراسية.

Introduction

دودة القز ، بومبيكس موري ، هي حشرة تم تدجينها منذ أكثر من 5000 عام في الصين. نظرا لقدرتها على إنتاج الحرير ، تعد دودة القز حشرة اقتصادية مهمة في الزراعة وتربية دودة القز الصينية. تأتي دودة القز في المرتبة الثانية بعد ذبابة الفاكهة كحشرة نموذجية. كحشرة نموذجية في حرشفيات الأجنحة ، من السهل تربية دودة القز ، مع حجم جسم كبير والكثير من المسوخ. وفي الوقت نفسه ، فإن دودة القز هي أول حشرة حرشفيات الأجنحة مع تسلسل جينومها الكامل¹. تتوفر أيضا الكثير من قواعد البيانات التي توفر معلومات عن الجينوم² ، والنسخ³ ، وعلامة التسلسل المعبر عنها (EST) ⁴

Protocol

1. أنواع دودة القز وتربيتها

1. خلف ما لا يقل عن 120 يرقات دودة القز الحديثة من B. mori P50 سلالة بأوراق التوت الطازجة عند 25 ± 1 درجة مئوية ، والفترة الضوئية 12 ساعة ضوء: 12 ساعة مظلمة ، و 75٪ ± 5٪ رطوبة نسبية.

2. اختيار يرقات دودة القز

1. اختر اليوم الأول من يرقات الطور الخامس لتجربة الحمض النووي الريبي. تنمو يرقات دودة القز بسرعة بعد اليوم 3 من الطور الخامس ، وهو مثالي لمقارنة الاختلافات في مظهر اليرقات.
   ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام المراحل الأصغر ، مثل الطور^{الثالث أو الرابع} ، لتجربة RNAi.

النتائج

لتقييم كفاءة الحمض النووي الريبي ، تم اختيار جين مناعي يستهدف BmToll9-2 للتحليل. يتميز جين BmToll9-2 جيدا في المختبر ، ويؤدي إسكات الجينات عن طريق حقن dsRNA إلى يرقات أخف وزنا وأصغر في منشورنا الأخير²⁰. لتأكيد فعالية الحمض النووي الريبي عن طريق الابتلاع من خلا?.......

Discussion

المرحلة المناسبة مهمة لمراقبة النمط الظاهري للحمض النووي الريبي ، اعتمادا على الجينات المستهدفة. أظهرت نتائجنا الأولية أن Toll9-2 متورط في نمو دودة القز. يزداد حجم ووزن يرقات دودة القز بسرعة عند الطور الخامس²¹. لذلك ، يتم اختيار يرقات الطور الخ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tube	Sangon	F601620	for dsRNA or nanoparticles reaction
10 μl pipette	Eppendorf	P13473G	to aspirate or resuspend liquid
100 μl pipette	Eppendorf	Q12115G	to aspirate or resuspend liquid
2.5 μl pipette	Eppendorf	P20777G	to aspirate or resuspend liquid
20 μl pipette	Eppendorf	H19229E	to aspirate or resuspend liquid
200 μl pipette	Eppendorf	H20588E	to aspirate or resuspend liquid
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Costar	3516	for silkworm rearing individually
Acetic acid	Aladdin	A116165	to make TAE
Agarose M	BBI Life Sciences	A610013	for agarose gel electrophosis
Analytical balance	Sartorius	BSA224S	to weight ingredients
Centrifuge	Sartorius	Centrisart A-14C	to centrifuge to form dsRNA or nanoparticles
Chitosan	Sigma-Aldrich	C3646	to combine with dsRNA for preparation of nanoparticles
EDTA	Sangon	A500895	to make TAE
Ethanol	Aladdin	E130059	to make TAE, or for dsRNA precipitation
Freezer	Siemens	iQ300	to store dsRNA or nanoparticles
GoTaq Green Master Mix	Promega	M712	for PCR reaction
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6002	for qRT-PCR reaction
Isopropanol	Aladdin	I112011	for dsRNA precipitation
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher	One	to determine the concentration of dsRNA
ph meter	Sartorius	PB-10	to prepare buffers
SanPrep Column PCR Product Purification Kit	Sangon	B518141	for PCR product purification
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889	to make 100 mM sodium acetate buffer
Sodium sulfate	Sigma-Aldrich	239313	to make 100 mM sodium sulfate buffer
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	for dsRNA synthesis
ThermoMixer	Eppendorf	C	for dsRNA generation or nanoparticles heating
Tris	Sangon	A501492	to make TAE
Vortex	IKA	Vortex 3	to prepare chitosan/dsRNA nanoparticles