Interferencia de ARN larvario en el gusano de seda Bombyx mori a través de la entrega de nanopartículas de quitosano/dsRNA

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para la administración de nanopartículas de quitosano/dsRNA en larvas de gusano de seda Bombyx mori para inducir el silenciamiento génico a través de la ingestión.

Resumen

El gusano de seda, Bombyx mori, es un importante insecto económico con miles de años de historia en China. Por su parte, el gusano de seda es el insecto modelo de los lepidópteros con una buena acumulación de investigación básica. También es el primer insecto de los lepidópteros con su genoma completo secuenciado y ensamblado, lo que proporciona una base sólida para el estudio de la funcionalidad de los genes. Aunque el ARN de interferencia (ARNi) se usa ampliamente en el estudio de la funcionalidad génica inversa, es refractario en gusanos de seda y otras especies de lepidópteros. Las investigaciones exitosas previas relacionadas con el ARNi para administrar ARN bicatenario (dsRNA) se realizaron solo mediante inyección. Nunca se informa de la entrega de dsRNA a través de la alimentación. En este artículo, describimos los procedimientos paso a paso para preparar las nanopartículas de quitosano/dsRNA, que se alimentan a las larvas de gusano de seda por ingestión. El protocolo incluye (i) la selección de la etapa adecuada de las larvas de gusano de seda, (ii) la síntesis de dsRNA, (iii) la preparación de las nanopartículas de quitosano/dsRNA y (iv) la alimentación de las larvas de gusano de seda con nanopartículas de quitosano/dsRNA. Se presentan resultados representativos, incluyendo la confirmación de la transcripción génica y la observación del fenotipo. La alimentación con dsRNA es una técnica sencilla para el ARNi en las larvas de gusanos de seda. Dado que las larvas de gusano de seda son fáciles de criar y lo suficientemente grandes como para operar, proporciona un buen modelo para demostrar el ARNi larvario en insectos. Además, la simplicidad de esta técnica estimula una mayor participación de los estudiantes en la investigación, lo que convierte a las larvas de gusano de seda en un sistema genético ideal para su uso en el aula.

Introducción

El gusano de seda, Bombyx mori, es un insecto domesticado hace más de 5000 años en China. Debido a su capacidad para producir seda, el gusano de seda es un insecto económico importante en la agricultura y la sericultura chinas. El gusano de seda ocupa el segundo lugar después de la mosca de la fruta como insecto modelo. Como insecto modelo en lepidópteros, el gusano de seda es fácil de criar, con un gran tamaño corporal y muchos mutantes. Por su parte, el gusano de seda es el primer insecto lepidóptero con su genoma completo secuenciado¹. También están disponibles para el público muchas bases de datos que proporcionan información sobre el genoma², el transcriptoma³, la etiqueta de secuencia expresada (EST)⁴, el ARN⁵ no codificante y el microsatélite⁶ . Los hechos anteriores hacen del gusano de seda un modelo perfecto para la investigación genética.

El ARN de interferencia (ARNi) es un proceso celular en el que las moléculas de ARN bicatenario (dsRNA) se unen y cortan el ARN mensajero complementario (ARNm), logrando así el efecto de silenciamiento del gen diana. Este mecanismo está presente de forma natural en las bacterias para defenderse de la invasión de virus⁷. Más tarde, se descubrió que el ARNi se conserva en animales, plantas y microbios. Debido a su potente efecto silenciador específico de secuencia, el ARNi se utiliza en investigación fundamental para manipular la expresión génica y estudiar la función de los genes. El ARNi se logra a través de la entrega de dsRNA a las células.

En los insectos, hay tres formas comunes de administrar dsRNA, que son la microinyección, la alimentación y el remojo⁸. Por el momento, los informes exitosos de ARNi en los gusanos de seda a través de la administración desnuda de dsRNA^se realizan mediante la inyección de dsRNA 9. Las ventajas de la microinyección son la administración inmediata de dsRNA en la hemolinfa y el control preciso de la cantidad de dsRNA. Sin embargo, también existen ciertas desventajas de la microinyección. Por ejemplo, requiere mucho tiempo y dispositivos delicados. También es importante optimizar las agujas de inyección, el volumen de inyección y la cantidad de dsRNA. Por lo tanto, se hace necesaria una forma alternativa de administrar dsRNA a los gusanos de seda. Debido a que el exoesqueleto de un insecto es una barrera hermética hecha de quitina, rara vez se informa sobre el remojo de larvas de insectos para lograr ARNi, lo que no es una buena opción para el ARNi en insectos. La alimentación de dsRNA ahorra trabajo, es rentable y fácil de realizar¹⁰. Este método también es aplicable para el cribado genético de alto rendimiento¹¹. Sin embargo, se ha descubierto que una nucleasa no específica de ADN/ARN, llamada BmdsRNasa, está presente en el intestino medio y en el jugo del intestino medio de las larvas de gusano de seda¹². Se ha demostrado que esta nucleasa digiere el dsRNA, preferiblemente¹³. Por lo tanto, alimentar al gusano de seda con dsRNA desnudo para silenciar la expresión génica parece ser difícil.

Recientemente, se ha demostrado que el dsRNA protegido por nanopartículas es una buena alternativa para aumentar la eficiencia del ARNi mediante la alimentación^{de 14}. El quitosano es un polímero barato, no tóxico y biodegradable, que puede prepararse mediante la desacetilación de la quitina, un biopolímero natural y el segundo más abundante después de la celulosa¹⁵. Debido a que el grupo amino en el quitosano está cargado positivamente y el grupo fosfato en la columna vertebral del dsRNA está cargado negativamente, las nanopartículas de quitosano/dsRNA podrían formarse por autoensamblaje de policationes¹⁶. Las nanopartículas de quitosano/dsRNA son efectivas para lograr ARNi a través de la alimentación de larvas en mosquitos Aedes aegypti y Anopheles gambiae¹⁷, gusano de la cápsula moteada del algodón Earias vittella¹⁸ y araña roja del carmín Tetranychus cinnabarinus¹⁹.

Con el fin de desarrollar una metodología para la administración de dsRNA mediante la alimentación de gusanos de seda para obtener una eficiencia exitosa de ARNi, este informe se centra en describir los procedimientos paso a paso sobre cómo preparar las nanopartículas de quitosano/dsRNA y alimentar las nanopartículas a las larvas de gusanos de seda. Esta metodología es relativamente barata, ahorra mano de obra y fácil de seguir, y puede adaptarse para estudios de silenciamiento génico en otros insectos. Nuestro objetivo es proporcionar un protocolo más fácil para el método de administración de dsRNA de lepidópteros con una mayor eficiencia de ARNi.

Protocolo

1. Especies de gusanos de seda y cría

1. Cría al menos 120 larvas de gusano de seda de 1er estadio recién eclosionadas de la cepa B. mori P50 con hojas frescas de morera a 25 ± 1 °C, fotoperiodo 12 h Luz:12 h Oscuridad y 75% ± 5% de humedad relativa.

2. Selección de larvas de gusano de seda

1. Elija el día 1 de las larvas del^5º estadio para el experimento de ARNi; Las larvas de gusano de seda crecen rápidamente después del día 3 del^5º estadio, lo que es ideal para comparar las diferencias en la apariencia de las larvas.
   NOTA: Alternativamente, las etapas más jóvenes, como el^3º o^4º estadio, podrían utilizarse para el experimento de ARNi. Sin embargo, requiere un tratamiento constante con dsRNA hasta el^5º estadio, que es relativamente caro y costoso en material.

3. Síntesis de dsRNA

1. Identificación del fragmento diana de dsRNA: Seleccione la secuencia codificante de un gen diana y alinéela con otros genes homólogos para determinar la región conservada. Diseñar cebadores específicos de genes en la región no conservada para la posterior amplificación de fragmentos diana de dsRNA. Para experimentos de ARNi en insectos, el fragmento objetivo típico de dsRNA es generalmente de 400-600 pb. El tamaño mínimo podría ser de 200 pb.
   NOTA: Para mejorar la eficiencia y la tasa de éxito de los experimentos de ARNi, se puede utilizar alguna herramienta basada en la web para diseñar el objetivo de dsRNA, como dsRNA Engineer (https://dsrna-engineer.cn/).
2. Producción de la plantilla de producto de PCR: Agregue un promotor de ARN polimerasa T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3') al extremo 5' de cualquiera de los cebadores diseñados anteriormente. Realice una PCR estándar para amplificar el fragmento objetivo de dsRNA. Ejecute un gel de agarosa al 1% en 1x TAE para verificar un solo producto de PCR del tamaño esperado. A continuación, purifique el producto de PCR con un kit de purificación (Tabla de Materiales) y utilícelo para la transcripción posterior.
   NOTA: Para almacenar el producto de PCR objetivo a largo plazo y obtener altos rendimientos, se sugiere ligar el producto de PCR a un plásmido. El plásmido debe ser linealizado antes de la reacción de PCR.
3. Generación de dsRNA: Utilice un sistema de ARNi T7 (Tabla de Materiales) para generar el dsRNA. Configure la reacción agregando los componentes a temperatura ambiente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mezclar la reacción pipeteando suavemente e incubar a 37 °C durante 30 min.
   NOTA: Para maximizar el rendimiento, la incubación a 37 °C se puede prolongar hasta 2-6 h. En el caso de las plantillas que contienen una estructura secundaria o ricas en GC, la incubación puede realizarse a 42 °C para mejorar el rendimiento de dsRNA.
4. Recocido para formar dsRNA: Incubar la reacción a 70 °C durante 10 min, luego enfriar lentamente a temperatura ambiente (~20 min). Esto recocirá el dsRNA.
5. Tratamiento con DNasa y RNasa: Pipetear 1 μL de la solución de RNasa suministrada en 199 μL de agua libre de nucleasas para hacer una solución de RNasa recién diluida. Añadir 1 μL de solución de RNasa recién diluida y 1 μL de la DNasa libre de RNasa RQ1 suministrada por cada 20 μL de volumen de reacción, mezclar suavemente e incubar a 37 °C durante 30 min. El ARN monocatenario (ssRNA) y el ADN molde de la reacción se eliminarán después de este tratamiento.
6. Precipitación de alcohol: Añadir 1 volumen de isopropanol o 2,5 volúmenes de etanol al 95% junto con 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M (pH 5,2) a la reacción. Mezcle la reacción por vórtice e incube en hielo durante 5 minutos para formar una masa turbia. Girar a máxima velocidad en una centrífuga durante 10 minutos para recoger una bolita blanca en el fondo del tubo. Deseche el sobrenadante y lave el pellet con 0,5 mL de etanol frío al 70% para eliminar la sal residual. Retire el etanol después del lavado. Deje que el pellet se seque al aire a temperatura ambiente durante 15 minutos. Vuelva a suspender el pellet con agua libre de nucleasas en 2-5 veces el volumen de reacción inicial. Almacenar a -20 °C o -70 °C.
   NOTA: El pellet de dsRNA no debe secarse demasiado, ya que esto podría dificultar la resuspensión completa. Para garantizar una resuspensión suficiente, se necesita un mínimo de 2 volúmenes.
7. Control de cantidad y calidad del dsRNA: Diluir el dsRNA en agua libre de nucleasas en una proporción de 1:100 a 1:300. Determine la concentración de dsRNA utilizando un espectrofotómetro de microvolumen (Tabla de materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para cuantificar el dsRNA, multiplique la concentración por el volumen. Para evaluar la calidad del dsRNA, utilice la electroforesis en gel de agarosa. Preparar un gel de agarosa al 1% en 1x TAE y diluir el dsRNA a 1:50 con agua sin nucleasas. Utilice 5 μL de dsRNA diluido por carril y tiña el gel con 0,5 mg/mL de bromuro de etidio durante al menos 15 min para la visualización.
   NOTA: el dsRNA migra más lentamente que el dsDNA.

4. Preparación de las nanopartículas de quitosano/dsRNA

1. Prepare 100 mM de acetato de sodio (0,1 M de NaC₂H,_3O2 y 0,1 M de ácido acético, pH 4,5 en agua desionizada) y 100 mM de sulfato de sodio (100 mM de Na_{, 2},_SO4 en agua desionizada) a temperatura ambiente.
2. Disolver el quitosano comercializado (de cáscaras de camarón, ≥75% desacetilado; Tabla de Materiales) en 100 mM de tampón de acetato de sodio para hacer una solución de quitosano al 0,02% (p/v).
3. Disuelva 20 μg de dsRNA en 50 μL de agua libre de nucleasa y agréguelo a 50 μL de tampón de sulfato de sodio de 100 mM para hacer una solución de dsRNA de 100 μL.
4. Añadir 100 μL de solución de quitosano a 100 μL de solución de dsRNA. Simultáneamente, prepare un control agregando 100 μL de solución de quitosano a 100 μL de 50 mM de sulfato de sodio. Mezclar y calentar las mezclas a 55 °C durante 1 min.
5. Agite la mezcla inmediatamente con un vórtice de alta velocidad durante 30 s para permitir la formación de las nanopartículas.
6. Centrifugar la mezcla a 13.000 x g a temperatura ambiente durante 10 min para obtener un pellet blanco. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mL. Deje que el pellet se seque al aire a temperatura ambiente durante 10 minutos.
7. Determine la concentración de dsRNA en el sobrenadante mediante el uso de un espectrofotómetro de microvolumen (Tabla de Materiales). Utilice el sobrenadante del control como un espacio en blanco. Multiplique la concentración por el volumen para calcular la cantidad total de dsRNA que queda en el sobrenadante. Calcule el porcentaje de dsRNA encapsulado en las nanopartículas por la cantidad que queda en el sobrenadante dividido por la cantidad inicial de dsRNA.
   NOTA: Aunque las nanopartículas pueden conservarse entre 4 y 37 °C durante al menos 15 días antes de su uso¹⁴, se sugiere utilizar las nanopartículas lo antes posible.

5. Alimentar las larvas de gusano de seda con nanopartículas de quitosano/dsRNA

1. Escoja larvas de gusano de seda recién mudadas del^5º estadio (es decir, el día 1 del^5º estadio) del mismo tamaño para el experimento de alimentación. Coloque las larvas individualmente en cada pocillo de una placa de 6 pocillos antes de cerrar la tapa y deje morir de hambre durante 24 h.
2. Enjuague las hojas de morera frescas con agua desionizada y séquelas con papel de cocina limpio. Las hojas de morera deben estar secas sin gotas de agua. Cortar en discos de hojas de morera de 1 cm x 1 cm.
3. Disuelva las nanopartículas de quitosano/dsRNA en agua libre de nucleasas a 500 ng/μL antes de su uso. Diluir las nanopartículas de quitosano control (preparadas en 4.4) con el mismo volumen de agua libre de nucleasas. Prepare dsRNA desnudo a 500 ng/μL en agua libre de nucleasas.
4. Utilice las nanopartículas de quitosano/dsRNA para el experimento de eliminación de ARNi, las nanopartículas de quitosano de control como control en blanco/negativo. Utilice el dsRNA desnudo para comparar las diferencias con las nanopartículas de quitosano/dsRNA.
5. Cubra 10 μL de nanopartículas de quitosano/dsRNA, quitosano y dsRNA desnudo en la superficie de cada disco de hoja, respectivamente. Seque al aire la solución de nanopartículas y la solución de dsRNA en los discos de las hojas a temperatura ambiente durante 5 minutos.
6. Alimente a cada larva con un disco de hoja recubierto de nanopartículas o dsRNA por día. Proporcione discos de hojas recubiertos de nanopartículas o dsRNA a las larvas de forma continua durante 5 días. Las hojas frescas de morera se pueden proporcionar después de que las larvas hayan comido completamente el disco de la hoja recubierta cada día.
7. El día 6, anestesiar las larvas en hielo hasta que no se muevan y diseccionar las larvas para su muestreo. Corta el tórax con unas tijeras en una placa de Petri limpia. Saca la tripa media con una pinza. Retire el contenido del intestino medio y lave el intestino medio en otra placa de Petri llena de agua sin nucleasas. Almacene el intestino medio en un tubo de 1,5 ml y manténgalo a -70 °C.

6. Confirmación del silenciamiento génico

1. Realice PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) para calcular la cuantificación relativa de la transcripción. Se requieren al menos tres réplicas biológicas y tres réplicas técnicas para cada réplica biológica. Se recomiendan al menos dos genes de referencia para normalizar la transcripción relativa. Se analiza un gen Bombyx Toll9-2 (BmToll9-2). Evalúe la eficiencia del silenciamiento génico comparando el valor medio de la transcripción relativa con el grupo de control y conviértalo en porcentaje.
   NOTA: La condición de amplificación de qRT-PCR, la información del cebador y el cálculo de la transcripción relativa se pueden encontrar en nuestra reciente publicación²⁰.
2. Analizar el fenotipo de ARNi para evaluar el efecto de silenciamiento génico. Observa el tamaño de las larvas y los capullos. Tome fotos diariamente para registrar las apariciones.
   NOTA: El ARNi puede afectar la morfología, la metamorfosis, la fisiología y el comportamiento. La observación de los fenotipos relacionados con el ARNi depende de los genes a los que se dirige.

Resultados

Para evaluar la eficiencia del ARNi, se eligió un gen inmune dirigido a BmToll9-2 para el análisis. El gen BmToll9-2 está bien caracterizado en el laboratorio, y el silenciamiento del gen mediante la inyección de dsRNA da como resultado larvas más ligeras y pequeñas en nuestra reciente publicación²⁰. Para confirmar la eficacia del ARNi por ingestión a través de nanopartículas de quitosano/dsRNA, se utilizaron nanopartículas de quitosan...

Discusión

Es importante una etapa adecuada para la observación del fenotipo del ARNi, dependiendo de los genes a los que se dirija. Nuestros resultados preliminares mostraron que Toll9-2 está involucrado en el crecimiento del gusano de seda. El tamaño y el peso de las larvas del gusano de seda aumentan rápidamente en el^5º estadio²¹. Por lo tanto, se seleccionan las larvas del^5º estadio como etapa para el experimento de alimentación de n...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tube	Sangon	F601620	for dsRNA or nanoparticles reaction
10 μl pipette	Eppendorf	P13473G	to aspirate or resuspend liquid
100 μl pipette	Eppendorf	Q12115G	to aspirate or resuspend liquid
2.5 μl pipette	Eppendorf	P20777G	to aspirate or resuspend liquid
20 μl pipette	Eppendorf	H19229E	to aspirate or resuspend liquid
200 μl pipette	Eppendorf	H20588E	to aspirate or resuspend liquid
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Costar	3516	for silkworm rearing individually
Acetic acid	Aladdin	A116165	to make TAE
Agarose M	BBI Life Sciences	A610013	for agarose gel electrophosis
Analytical balance	Sartorius	BSA224S	to weight ingredients
Centrifuge	Sartorius	Centrisart A-14C	to centrifuge to form dsRNA or nanoparticles
Chitosan	Sigma-Aldrich	C3646	to combine with dsRNA for preparation of nanoparticles
EDTA	Sangon	A500895	to make TAE
Ethanol	Aladdin	E130059	to make TAE, or for dsRNA precipitation
Freezer	Siemens	iQ300	to store dsRNA or nanoparticles
GoTaq Green Master Mix	Promega	M712	for PCR reaction
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6002	for qRT-PCR reaction
Isopropanol	Aladdin	I112011	for dsRNA precipitation
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher	One	to determine the concentration of dsRNA
ph meter	Sartorius	PB-10	to prepare buffers
SanPrep Column PCR Product Purification Kit	Sangon	B518141	for PCR product purification
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889	to make 100 mM sodium acetate buffer
Sodium sulfate	Sigma-Aldrich	239313	to make 100 mM sodium sulfate buffer
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	for dsRNA synthesis
ThermoMixer	Eppendorf	C	for dsRNA generation or nanoparticles heating
Tris	Sangon	A501492	to make TAE
Vortex	IKA	Vortex 3	to prepare chitosan/dsRNA nanoparticles