Interferencia de ARN larvario en el gusano de seda Bombyx mori a través de la entrega de nanopartículas de quitosano/dsRNA

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para la administración de nanopartículas de quitosano/dsRNA en larvas de gusano de seda Bombyx mori para inducir el silenciamiento génico a través de la ingestión.

Resumen

El gusano de seda, Bombyx mori, es un importante insecto económico con miles de años de historia en China. Por su parte, el gusano de seda es el insecto modelo de los lepidópteros con una buena acumulación de investigación básica. También es el primer insecto de los lepidópteros con su genoma completo secuenciado y ensamblado, lo que proporciona una base sólida para el estudio de la funcionalidad de los genes. Aunque el ARN de interferencia (ARNi) se usa ampliamente en el estudio de la funcionalidad génica inversa, es refractario en gusanos de seda y otras especies de lepidópteros. Las investigaciones exitosas previas relacionadas con el ARNi para administrar ARN bicatenario (dsRNA) se realizaron solo mediante inyección. Nunca se informa de la entrega de dsRNA a través de la alimentación. En este artículo, describimos los procedimientos paso a paso para preparar las nanopartículas de quitosano/dsRNA, que se alimentan a las larvas de gusano de seda por ingestión. El protocolo incluye (i) la selección de la etapa adecuada de las larvas de gusano de seda, (ii) la síntesis de dsRNA, (iii) la preparación de las nanopartículas de quitosano/dsRNA y (iv) la alimentación de las larvas de gusano de seda con nanopartículas de quitosano/dsRNA. Se presentan resultados representativos, incluyendo la confirmación de la transcripción génica y la observación del fenotipo. La alimentación con dsRNA es una técnica sencilla para el ARNi en las larvas de gusanos de seda. Dado que las larvas de gusano de seda son fáciles de criar y lo suficientemente grandes como para operar, proporciona un buen modelo para demostrar el ARNi larvario en insectos. Además, la simplicidad de esta técnica estimula una mayor participación de los estudiantes en la investigación, lo que convierte a las larvas de gusano de seda en un sistema genético ideal para su uso en el aula.

Introducción

El gusano de seda, Bombyx mori, es un insecto domesticado hace más de 5000 años en China. Debido a su capacidad para producir seda, el gusano de seda es un insecto económico importante en la agricultura y la sericultura chinas. El gusano de seda ocupa el segundo lugar después de la mosca de la fruta como insecto modelo. Como insecto modelo en lepidópteros, el gusano de seda es fácil de criar, con un gran tamaño corporal y muchos mutantes. Por su parte, el gusano de seda es el primer insecto lepidóptero con su genoma completo secuenciado¹. También están disponibles para el público muchas bases de datos ....

Protocolo

1. Especies de gusanos de seda y cría

1. Cría al menos 120 larvas de gusano de seda de 1er estadio recién eclosionadas de la cepa B. mori P50 con hojas frescas de morera a 25 ± 1 °C, fotoperiodo 12 h Luz:12 h Oscuridad y 75% ± 5% de humedad relativa.

2. Selección de larvas de gusano de seda

1. Elija el día 1 de las larvas del^5º estadio para el experimento de ARNi; Las larvas de gusano de seda crecen rápidamente después del día 3 del^5º estadio, lo que es ideal para comparar las diferencias en la apariencia de las ....

Discusión

Es importante una etapa adecuada para la observación del fenotipo del ARNi, dependiendo de los genes a los que se dirija. Nuestros resultados preliminares mostraron que Toll9-2 está involucrado en el crecimiento del gusano de seda. El tamaño y el peso de las larvas del gusano de seda aumentan rápidamente en el^5º estadio²¹. Por lo tanto, se seleccionan las larvas del^5º estadio como etapa para el experimento de alimentación de n.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tube	Sangon	F601620	for dsRNA or nanoparticles reaction
10 μl pipette	Eppendorf	P13473G	to aspirate or resuspend liquid
100 μl pipette	Eppendorf	Q12115G	to aspirate or resuspend liquid
2.5 μl pipette	Eppendorf	P20777G	to aspirate or resuspend liquid
20 μl pipette	Eppendorf	H19229E	to aspirate or resuspend liquid
200 μl pipette	Eppendorf	H20588E	to aspirate or resuspend liquid
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Costar	3516	for silkworm rearing individually
Acetic acid	Aladdin	A116165	to make TAE
Agarose M	BBI Life Sciences	A610013	for agarose gel electrophosis
Analytical balance	Sartorius	BSA224S	to weight ingredients
Centrifuge	Sartorius	Centrisart A-14C	to centrifuge to form dsRNA or nanoparticles
Chitosan	Sigma-Aldrich	C3646	to combine with dsRNA for preparation of nanoparticles
EDTA	Sangon	A500895	to make TAE
Ethanol	Aladdin	E130059	to make TAE, or for dsRNA precipitation
Freezer	Siemens	iQ300	to store dsRNA or nanoparticles
GoTaq Green Master Mix	Promega	M712	for PCR reaction
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6002	for qRT-PCR reaction
Isopropanol	Aladdin	I112011	for dsRNA precipitation
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher	One	to determine the concentration of dsRNA
ph meter	Sartorius	PB-10	to prepare buffers
SanPrep Column PCR Product Purification Kit	Sangon	B518141	for PCR product purification
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889	to make 100 mM sodium acetate buffer
Sodium sulfate	Sigma-Aldrich	239313	to make 100 mM sodium sulfate buffer
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	for dsRNA synthesis
ThermoMixer	Eppendorf	C	for dsRNA generation or nanoparticles heating
Tris	Sangon	A501492	to make TAE
Vortex	IKA	Vortex 3	to prepare chitosan/dsRNA nanoparticles