Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada sunulan, ipekböceği Bombyx mori larvalarında yutma yoluyla gen susturmayı indüklemek için kitosan/dsRNA nanopartikül dağıtımı için bir protokoldür.

Özet

İpekböceği, Bombyx mori, Çin'de binlerce yıllık geçmişi olan önemli bir ekonomik böcektir. Bu arada, ipekböceği, iyi bir temel araştırma birikimi ile Lepidoptera'nın model böceği. Aynı zamanda, Lepidoptera'daki ilk böcek, tam genomu dizilenmiş ve bir araya getirilmiştir, bu da gen fonksiyonel çalışması için sağlam bir temel sağlar. RNA interferansı (RNAi), ters gen fonksiyonel çalışmasında yaygın olarak kullanılmasına rağmen, ipekböcekleri ve diğer Lepidopteran türlerinde refrakterdir. Çift sarmallı RNA (dsRNA) sağlamak için önceki başarılı RNAi ile ilgili araştırmalar yalnızca enjeksiyon yoluyla gerçekleştirildi. dsRNA'nın beslenme yoluyla iletilmesi hiçbir zaman rapor edilmez. Bu yazıda, ipekböceği larvalarına yutularak beslenen kitosan/dsRNA nanopartiküllerini hazırlamak için adım adım prosedürleri açıklıyoruz. Protokol, (i) ipekböceği larvalarının uygun aşamasının seçilmesini, (ii) dsRNA'nın sentezini, (iii) kitosan/dsRNA nanopartiküllerinin hazırlanmasını ve (iv) ipekböceği larvalarının kitosan/dsRNA nanopartikülleri ile beslenmesini içerir. Gen transkripti doğrulaması ve fenotip gözlemi dahil olmak üzere temsili sonuçlar sunulmuştur. dsRNA besleme, ipekböceği larvalarında RNAi için basit bir tekniktir. İpekböceği larvalarının yetiştirilmesi kolay ve çalıştırılabilecek kadar büyük olduğundan, böceklerde larva RNAi'sini göstermek için iyi bir model sağlar. Ek olarak, bu tekniğin basitliği, araştırmaya daha fazla öğrenci katılımını teşvik ederek ipekböceği larvalarını sınıf ortamında kullanım için ideal bir genetik sistem haline getirir.

Giriş

İpekböceği, Bombyx mori, 5000 yıldan daha uzun bir süre önce Çin'de evcilleştirilmiş bir böcek. İpekböceği, ipek üretme kabiliyeti nedeniyle Çin tarımında ve ipekböcekçiliğinde önemli bir ekonomik böcektir. İpekböceği, model böcek olarak meyve sineğinden sonra ikinci sıradadır. Lepidoptera'da model bir böcek olan ipekböceğinin yetiştirilmesi kolaydır, büyük bir vücut büyüklüğü ve bol miktarda mutant vardır. Bu arada, ipekböceği, tam genomu dizilenmiş ilk Lepidopteran böceğidir1. Genom2, transkriptom3, eksprese edilmiş dizi etiketi (EST)4, kodlamayan RNA5 ve mikrosatellit6 için bilgi sağlayan birçok veri tabanı da halka açıktır. Yukarıdaki gerçekler ipekböceğini genetik araştırmalar için mükemmel bir model haline getirmektedir.

RNA interferansı (RNAi), çift sarmallı RNA (dsRNA) moleküllerinin tamamlayıcı haberci RNA'yı (mRNA) bağlayıp dilimlediği, böylece hedef genin susturma etkisini elde ettiği hücresel bir süreçtir. Bu mekanizma, virüslerin istilasına karşı savunmak için bakterilerde doğal olarak bulunur7. Daha sonra RNAi'nin hayvanlarda, bitkilerde ve mikroplarda korunduğu bulundu. Güçlü diziye özgü susturma etkisi nedeniyle, RNAi, gen ekspresyonunu manipüle etmek ve gen fonksiyonunu incelemek için temel araştırmalarda kullanılır. RNAi, dsRNA'nın hücrelere verilmesi yoluyla elde edilir.

Böceklerde, dsRNA'yı iletmenin mikroenjeksiyon, besleme ve ıslatma olmak üzere üç yaygın yolu vardır8. Şu anda, ipekböceklerinde çıplak dsRNA iletimi yoluyla başarılı RNAi raporları, dsRNA enjeksiyonu9 ile gerçekleştirilmektedir. Mikroenjeksiyonun avantajları, dsRNA'nın hemolenf içine anında verilmesi ve dsRNA miktarının hassas bir şekilde kontrol edilmesidir. Bununla birlikte, mikroenjeksiyonun bazı dezavantajları da mevcuttur. Örneğin, zaman alıcıdır ve hassas cihazlar gerektirir. Enjeksiyon iğnelerini, enjeksiyon hacmini ve dsRNA miktarını optimize etmek de önemlidir. Bu nedenle, dsRNA'yı ipekböceklerine iletmenin alternatif bir yolu gerekli hale gelir. Bir böceğin dış iskeleti, kitinden yapılmış su geçirmez bir bariyer olduğundan, RNAi'yi elde etmek için böcek larvalarının ıslatılması nadiren rapor edilir, bu da böceklerde RNAi için iyi bir seçenek değildir. dsRNA'nın beslenmesi emek tasarrufu sağlar, uygun maliyetlidir ve gerçekleştirilmesi kolaydır10. Bu yöntem aynı zamanda yüksek verimli gen taraması için de geçerlidir11. Bununla birlikte, ipekböceği larvalarının12 orta bağırsak ve orta bağırsak suyunda DNA/RNA spesifik olmayan bir nükleazın, yani BmdsRNaz'ın bulunduğu bulunmuştur. Bu nükleazın dsRNA'yı, tercihen13'ü sindirdiği gösterilmiştir. Bu nedenle, gen ifadesini susturmak için ipekböceğine çıplak dsRNA beslemek zor gibi görünüyor.

Son zamanlarda, nanopartikül korumalı dsRNA'nın,14'ü besleyerek RNAi verimliliğini artırmak için iyi bir alternatif olduğu kanıtlanmıştır. Kitosan, selüloz15'ten sonra doğal olarak oluşan ve en bol bulunan ikinci biyopolimer olan kitinin deasetilasyonu ile hazırlanabilen ucuz, toksik olmayan ve biyolojik olarak parçalanabilen bir polimerdir. Kitosan içindeki amino grubu pozitif yüklü olduğundan ve dsRNA'nın omurgasındaki fosfat grubu negatif yüklü olduğundan, kitosan / dsRNA nanopartikülleri, polikatyonların16 kendi kendine bir araya gelmesiyle oluşturulabilir. Kitosan / dsRNA nanopartikülleri, sivrisinekler Aedes aegypti ve Anopheles gambiae17, pamuk benekli koza kurdu Earias vittella18 ve karmin örümcek akarı Tetranychus cinnabarinus19'da larva besleme yoluyla RNAi elde etmede etkilidir.

Başarılı RNAi verimliliği elde etmek için ipekböceklerinde beslenerek dsRNA iletimi için bir metodoloji geliştirmek amacıyla, bu rapor, kitosan/dsRNA nanopartiküllerinin nasıl hazırlanacağına ve nanopartiküllerin ipekböceği larvalarına nasıl besleneceğine ilişkin adım adım prosedürleri açıklamaya odaklanmaktadır. Bu metodoloji nispeten ucuzdur, emek tasarrufu sağlar ve takip edilmesi kolaydır, bu da diğer böceklerde gen susturma çalışmaları için uyarlanabilir. Daha yüksek RNAi verimliliği ile Lepidopteran dsRNA dağıtım yöntemi için daha kolay bir protokol sağlamayı amaçlıyoruz.

Protokol

1. İpekböceği türleri ve yetiştiriciliği

  1. Taze dut yaprakları ile 25 ± 1 °C'de, fotoperiyot 12 saat Aydınlık: 12 saat Karanlık ve% 75 ±% 5 bağıl nemde, taze dut yaprakları ile B. mori P50 suşunun en az 120yumurtadan yeni çıkmış 1. instar ipekböceği larvalarını arkaya koyun.

2. İpekböceği larvalarının seçimi

  1. RNAi deneyi için 5. instar larvalarının 1. gününü seçin; İpekböceği larvaları, larva görünümündeki farklılıkları karşılaştırmak için ideal olan 5.instarın 3. gününden sonra hızlı bir şekilde büyür.
    NOT: Alternatif olarak, RNAi deneyi için 3. veya 4. instar gibi daha genç aşamalar kullanılabilir. Bununla birlikte, nispeten pahalı ve malzeme maliyeti olan 5.instar'a kadar sürekli dsRNA tedavisi gerektirir.

3. dsRNA'nın sentezi

  1. dsRNA hedef fragmanının tanımlanması: Bir hedef genin kodlama dizisini seçin ve korunan bölgeyi belirlemek için onu diğer homojen genlerle hizalayın. Sonraki dsRNA hedef fragman amplifikasyonu için korunmamış bölgede gene özgü primerler tasarlayın. Böceklerde yapılan RNAi deneyleri için, tipik dsRNA hedef fragmanı genellikle 400-600 bp'dir. Minimum boyut 200 bp olabilir.
    NOT: RNAi deneylerinin verimliliğini ve başarılı oranını artırmak için, dsRNA hedefini tasarlamak için dsRNA Mühendisi (https://dsrna-engineer.cn/) gibi bazı web tabanlı araçlar kullanılabilir.
  2. PCR ürün şablonu üretme: Yukarıda tasarlanan her iki primerin 5' ucuna bir T7 RNA polimeraz promotörü (3'-TAATACGACTCACTATAGG-5') ekleyin. dsRNA hedef fragmanını yükseltmek için standart PCR gerçekleştirin. Beklenen boyutta tek bir PCR ürününü doğrulamak için 1x TAE'de %1'lik bir agaroz jeli çalıştırın. Bundan sonra, PCR ürününü bir saflaştırma kiti (Malzeme Tablosu) ile saflaştırın ve sonraki transkripsiyon için kullanın.
    NOT: Hedef PCR ürününü uzun süre saklamak ve yüksek verim elde etmek için PCR ürününün bir plazmide bağlanması önerilir. Plazmit, PCR reaksiyonundan önce doğrusallaştırılmalıdır.
  3. dsRNA'nın Üretilmesi: dsRNA'yı oluşturmak için bir T7 RNAi Sistemi (Malzeme Tablosu) kullanın. Bileşenleri üreticinin talimatlarına göre oda sıcaklığında ekleyerek reaksiyonu ayarlayın. Reaksiyonu nazikçe pipetleyerek karıştırın ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
    NOT: Verimi en üst düzeye çıkarmak için, 37 ° C'de inkübasyon 2-6 saate kadar uzatılabilir. İkincil bir yapı veya GC açısından zengin şablonlar için, dsRNA verimini artırmak yerine 42 °C'de inkübasyon gerçekleştirilebilir.
  4. dsRNA oluşturmak için tavlama: Reaksiyonu 70 °C'de 10 dakika inkübe edin, ardından yavaşça oda sıcaklığına (~ 20 dakika) soğutun. Bu, dsRNA'yı tavlayacaktır.
  5. DNaz ve RNaz tedavisi: Taze seyreltilmiş bir RNaz çözeltisi yapmak için verilen RNase çözeltisinin 1 μL'sini 199 μL nükleaz içermeyen suya pipetleyin. 20 μL reaksiyon hacmi başına 1 μL taze seyreltilmiş RNaz çözeltisi ve 1 μL sağlanan RQ1 RNaz içermeyen DNaz ekleyin, hafifçe karıştırın ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Tek sarmallı RNA (ssRNA) ve reaksiyondaki şablon DNA bu işlemden sonra çıkarılacaktır.
  6. Alkol çökeltme: Reaksiyona 1 hacim izopropanol veya 2.5 hacim %95 etanol ile birlikte 0.1 hacim 3 M Sodyum Asetat (pH 5.2) ekleyin. Reaksiyonu girdap yaparak karıştırın ve bulutlu bir kütle oluşturmak için 5 dakika buz üzerinde inkübe edin. Tüpün dibinde beyaz bir pelet toplamak için bir santrifüjde 10 dakika boyunca maksimum hızda döndürün. Süpernatanı atın ve kalan tuzu çıkarmak için peleti 0,5 mL soğuk %70 etanol ile yıkayın. Yıkamadan sonra etanolü çıkarın. Peletin oda sıcaklığında 15 dakika kurumaya bırakın. Pelet, ilk reaksiyon hacminin 2-5 katı kadar nükleaz içermeyen su ile yeniden süspanse edin. -20 °C veya -70 °C'de saklayın.
    NOT: dsRNA peleti aşırı kurutulmamalıdır, çünkü bu, tamamen yeniden süspanse edilmesini zorlaştırabilir. Yeterli yeniden süspansiyonu sağlamak için en az 2 hacme ihtiyaç vardır.
  7. DsRNA'nın miktar ve kalite kontrolü: dsRNA'yı nükleaz içermeyen suda 1:100 ila 1:300 oranında seyreltin. Üreticinin talimatlarına göre bir mikro hacim spektrofotometresi (Malzeme Tablosu) kullanarak dsRNA konsantrasyonunu belirleyin. dsRNA'yı ölçmek için konsantrasyonu hacimle çarpın. DsRNA'nın kalitesini değerlendirmek için agaroz jel elektroforezi kullanın. 1x TAE'de %1'lik bir agaroz jeli hazırlayın ve dsRNA'yı 1:50'de nükleaz içermeyen suyla seyreltin. Şerit başına 5 μL seyreltilmiş dsRNA kullanın ve görselleştirme için jeli en az 15 dakika boyunca 0,5 mg/mL etidyum bromür içinde boyayın.
    NOT: dsRNA, dsDNA'dan daha yavaş göç eder.

4. Kitosan / dsRNA nanopartiküllerinin hazırlanması

  1. Oda sıcaklığında 100 mM sodyum asetat (0.1 M NaC2H3O2 ve 0.1 M asetik asit, deiyonize suda pH 4.5) ve 100 mM sodyum sülfat (deiyonize suda 100 mM Na2S4) tamponu yapın.
  2. Ticarileştirilmiş kitosanı çözün (karides kabuklarından,% ≥75 deasetillenmiş; Malzeme Tablosu) % 0.02 (a / h) kitosan çözeltisi yapmak için 100 mM sodyum asetat tamponu içinde.
  3. 20 μg dsRNA'yı 50 μL nükleaz içermeyen suda çözün ve 100 μL'lik bir dsRNA çözeltisi yapmak için 50 μL 100 mM sodyum sülfat tamponuna ekleyin.
  4. 100 μL dsRNA çözeltisine 100 μL kitosan çözeltisi ekleyin. Eşzamanlı olarak, 100 μL 50 mM sodyum sülfata 100 μL kitosan çözeltisi ekleyerek bir kontrol hazırlayın. Karışımları karıştırın ve 55 °C'de 1 dakika ısıtın.
  5. Nanopartiküllerin oluşumuna izin vermek için karışımı hemen 30 saniye boyunca yüksek hızlı bir girdapla girdaplayın.
  6. Beyaz bir pelet elde etmek için karışımı oda sıcaklığında 13.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı 1.5 mL'lik yeni bir tüpe aktarın. Peletin oda sıcaklığında 10 dakika kurumaya bırakın.
  7. Bir mikrohacim spektrofotometresi (Malzeme Tablosu) kullanarak süpernatanttaki dsRNA konsantrasyonunu belirleyin. Kontroldeki süpernatanı boş olarak kullanın. Süpernatantta kalan toplam dsRNA miktarını hesaplamak için konsantrasyonu hacimle çarpın. Nanopartiküllerde kapsüllenen dsRNA yüzdesini, süpernatantta kalan miktarın dsRNA'nın başlangıç miktarına bölünmesiyle hesaplayın.
    NOT: Nanopartiküller kullanımdan önce en az 15 gün boyunca 4-37 ° C'de tutulabilse de14, nanopartiküllerin mümkün olan en kısa sürede kullanılması önerilir.

5. İpekböceği larvalarının kitosan/dsRNA nanopartikülleri ile beslenmesi

  1. Besleme deneyi için aynı büyüklükte taze tüy dökmüş 5. instar ipekböceği larvalarını (yani, 5. instarın 1. günü) seçin. Kapağı kapatmadan önce larvaları 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna ayrı ayrı yerleştirin ve 24 saat aç bırakın.
  2. Taze dut yapraklarını deiyonize su ile durulayın ve temiz mutfak kağıdı ile kurulayın. Dut yaprakları su damlası olmadan kuru olmalıdır. 1 cm x 1 cm dut yaprağı diskleri halinde kesin.
  3. Kullanmadan önce kitosan / dsRNA nanopartiküllerini 500 ng / μL'de nükleaz içermeyen suda çözün. Kontrol kitosan nanopartiküllerini (4.4'te hazırlanmış) aynı hacimde nükleaz içermeyen su ile seyreltin. Nükleaz içermeyen suda 500 ng/μL'ye kadar çıplak dsRNA hazırlayın.
  4. RNAi knockdown deneyi için kitosan / dsRNA nanopartiküllerini, kontrol kitosan nanopartiküllerini boş / negatif kontrol olarak kullanın. Kitosan/dsRNA nanopartikülleri ile farklılıkları karşılaştırmak için çıplak dsRNA'yı kullanın.
  5. Her bir yaprak diskinin yüzeyine sırasıyla 10 μL kitosan/dsRNA nanopartikülleri, kitosan ve çıplak dsRNA kaplayın. Yaprak diskler üzerindeki nanopartikül çözeltisini ve dsRNA çözeltisini oda sıcaklığında 5 dakika havayla kurutun.
  6. Her larvayı günde bir nanopartikül kaplı veya dsRNA kaplı yaprak diski ile besleyin. Larvalara 5 gün boyunca sürekli olarak nanopartikül kaplı veya dsRNA kaplı yaprak diskleri sağlayın. Kaplanmış yaprak diski her gün larvalar tarafından tamamen yendikten sonra taze dut yaprağı sağlanabilir.
  7. 6. günde, larvaları hareket etmeyene kadar buz üzerinde uyuşturun ve larvaları örnekleme için inceleyin. Göğüs kafesi temiz bir Petri kabında makasla kesin. Bir cımbız ile orta bağırsağı dışarı çekin. Orta bağırsaktaki içeriği çıkarın ve orta bağırsağı nükleaz içermeyen suyla dolu başka bir Petri kabında yıkayın. Orta bağırsağı 1,5 mL'lik bir tüpte saklayın ve -70 °C'de tutun.

6. Gen susturmanın doğrulanması

  1. Bağıl transkript nicelemesini hesaplamak için kantitatif Gerçek Zamanlı PCR (qRT-PCR) gerçekleştirin. En az üç biyolojik kopya ve her biyolojik kopya için üç teknik kopya gereklidir. Göreceli transkripti normalleştirmek için en az iki referans gen önerilir. Bir Bombyx Toll9-2 (BmToll9-2) geni test edildi. Bağıl transkriptin ortalama değerini kontrol grubuyla karşılaştırarak gen susturma verimliliğini değerlendirin ve bunu yüzdeye dönüştürün.
    NOT: qRT-PCR amplifikasyon koşulu, primer bilgileri ve bağıl transkript hesaplaması son yayınımız20'de bulunabilir.
  2. Gen susturma etkisini değerlendirmek için RNAi fenotipini analiz edin. Larva ve kozaların boyutunu gözlemleyin. Görünümleri kaydetmek için her gün fotoğraf çekin.
    NOT: RNAi morfolojiyi, metamorfozu, fizyolojiyi ve davranışı etkileyebilir. RNAi ile ilişkili fenotiplerin gözlemlenmesi, hedeflenen genlere bağlıdır.

Sonuçlar

RNAi verimliliğini değerlendirmek için, analiz için BmToll9-2'yi hedefleyen bir bağışıklık geni seçildi. BmToll9-2 geni laboratuvarda iyi karakterize edilmiştir ve dsRNA enjeksiyonu ile gen susturma, son yayınımız20'de daha hafif ve daha küçük larvalarla sonuçlanır. Kitosan / dsRNA nanopartikülleri yoluyla yutularak RNAi etkinliğini doğrulamak için, kitosan nanopartikülleri kontrol olarak kullanıldı ve aynı anda çıpla...

Tartışmalar

Hedeflenen genlere bağlı olarak RNAi fenotip gözlemi için uygun bir aşama önemlidir. Ön sonuçlarımız, Toll9-2'nin ipekböceğinin büyümesinde rol oynadığını gösterdi. İpekböceği larvalarının büyüklüğü ve ağırlığı 5. instar 21'de hızla artar. Bu nedenle, 5. instar larvaları, kitosan/dsRNA nanopartikül besleme deneyi için aşama olarak seçilir. Besleme deneyleri için 3. veya 4. inst...

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31501898), Guangzhou Bilim ve Teknoloji Programı (202102010465), Guangzhou Yüksek Öğrenim Öğretim Kalitesi ve Öğretim Reformu Projesi (2022JXGG057) ve Guangdong Eyalet Üniversiteleri Açık Çevrimiçi Ders Yönlendirme Komitesi Araştırma projesi (2022ZXKC381) tarafından finanse edilmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL centrifuge tubeSangonF601620for dsRNA or nanoparticles reaction
10 μl pipetteEppendorfP13473Gto aspirate or resuspend liquid
100 μl pipetteEppendorfQ12115Gto aspirate or resuspend liquid
2.5 μl pipetteEppendorfP20777Gto aspirate or resuspend liquid
20 μl pipetteEppendorfH19229Eto aspirate or resuspend liquid
200 μl pipetteEppendorfH20588Eto aspirate or resuspend liquid
6-well Clear TC-treated Multiple Well PlatesCostar3516for silkworm rearing individually
Acetic acidAladdinA116165to make TAE
Agarose MBBI Life SciencesA610013for agarose gel electrophosis
Analytical balanceSartoriusBSA224Sto weight ingredients
Centrifuge SartoriusCentrisart A-14Cto centrifuge to form dsRNA or nanoparticles
ChitosanSigma-AldrichC3646to combine with dsRNA for preparation of nanoparticles
EDTASangonA500895to make TAE
EthanolAladdinE130059to make TAE, or for dsRNA precipitation
FreezerSiemensiQ300to store dsRNA or nanoparticles
GoTaq Green Master MixPromegaM712for PCR reaction
GoTaq qPCR Master MixPromegaA6002for qRT-PCR reaction
Isopropanol AladdinI112011for dsRNA precipitation
NanoDrop Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermoFisherOneto determine the concentration of dsRNA
ph meterSartorius PB-10to prepare buffers
SanPrep Column PCR Product Purification KitSangonB518141for PCR product purification
Sodium acetateSigma-AldrichS2889to make 100 mM sodium acetate buffer
Sodium sulfate Sigma-Aldrich239313to make 100 mM sodium sulfate buffer
T7 RiboMAX Express RNAi SystemPromegaP1700for dsRNA synthesis
ThermoMixerEppendorfCfor dsRNA generation or nanoparticles heating
TrisSangonA501492to make TAE
Vortex IKAVortex 3to prepare chitosan/dsRNA nanoparticles

Referanslar

  1. Xia, Q., et al. A draft sequence for the genome of the domesticated silkworm (bombyx mori). Science. 306 (5703), 1937-1940 (2004).
  2. Kawamoto, M., Kiuchi, T., Katsuma, S. Silkbase: An integrated transcriptomic and genomic database for bombyx mori and related species. Database (Oxford). 2022, (2022).
  3. Yokoi, K., Tsubota, T., Jouraku, A., Sezutsu, H., Bono, H. Reference transcriptome data in silkworm bombyx mori. Insects. 12 (6), (2021).
  4. Mita, K., et al. The construction of an est database for bombyx mori and its application. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14121-14126 (2003).
  5. Zhou, Q. Z., Zhang, B., Yu, Q. Y., Zhang, Z. Bmncrnadb: A comprehensive database of non-coding rnas in the silkworm, bombyx mori. BMC Bioinformatics. 17 (1), 370 (2016).
  6. Prasad, M. D., et al. Silksatdb: A microsatellite database of the silkworm, bombyx mori. Nucleic Acids Res. 33 (Database issue), D403-D406 (2005).
  7. Ding, S. W. Rna-based antiviral immunity. Nat Rev Immunol. 10 (9), 632-644 (2010).
  8. Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: An overview and future directions. Insect Sci. 20 (1), 4-14 (2013).
  9. Liang, Y., et al. Silencing of the immune gene bmpgrp-l4 in the midgut affects the growth of silkworm (bombyx mori) larvae. Insect Mol Biol. 32 (4), 340-351 (2023).
  10. Tian, H., et al. Developmental control of a lepidopteran pest Spodoptera exigua by ingestion of bacteria expressing dsrna of a non-midgut gene. PLoS One. 4 (7), e6225 (2009).
  11. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific rna-mediated interference through ingested double-stranded rna in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002 (2001).
  12. Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. Molecular characterization of a cdna encoding extracellular dsrnase and its expression in the silkworm Bombyx Mori. Insect Biochem Mol Biol. 37 (2), 176-183 (2007).
  13. Liu, J., Swevers, L., Iatrou, K., Huvenne, H., Smagghe, G. Bombyx mori DNA/rna non-specific nuclease: Expression of isoforms in insect culture cells, subcellular localization and functional assays. J Insect Physiol. 58 (8), 1166-1176 (2012).
  14. Christiaens, O., et al. Increased rnai efficacy in Spodoptera exigua via the formulation of dsrna with guanylated polymers. Front Physiol. 9, 316 (2018).
  15. Dass, C. R., Choong, P. F. The use of chitosan formulations in cancer therapy. J Microencapsul. 25 (4), 275-279 (2008).
  16. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect Mol Biol. 19 (5), 683-693 (2010).
  17. Zhang, X., et al. Chitosan/interfering rna nanoparticle mediated gene silencing in disease vector mosquito larvae. J Vis Exp. (97), e52523 (2015).
  18. Sandal, S., et al. Nanoparticle-shielded dsrna delivery for enhancing rnai efficiency in cotton spotted bollworm Earias vittella (lepidoptera: Nolidae). Int J Mol Sci. 24 (11), 9161 (2023).
  19. Zhou, H., et al. Chitosan/dsrna polyplex nanoparticles advance environmental rna interference efficiency through activating clathrin-dependent endocytosis. Int J Biol Macromol. 253 (Pt 4), 127021 (2023).
  20. Liu, J., et al. Immunological function of bombyx toll9-2 in the silkworm (Bombyx mori) larval midgut: Activation by escherichia coli/lipopolysaccharide and regulation of growth. Arch Insect Biochem Physiol. 116 (4), e22130 (2024).
  21. Cheng, L., et al. Characterization of silkworm larvae growth and properties of silk fibres after direct feeding of copper or silver nanoparticles. Mater Design. 129, 125-134 (2017).
  22. Wang, K., et al. Comparison of efficacy of rnai mediated by various nanoparticles in the rice striped stem borer (Chilo suppressalis). Pestic Biochem Physiol. 165, 104467 (2020).
  23. Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Chitosan nanoparticles help double-stranded rna escape from endosomes and improve rna interference in the fall armyworm, Spodoptera frugiperda. Arch Insect Biochem Physiol. 104 (4), e21677 (2020).
  24. Qi, J., et al. Rational design of ros scavenging and fluorescent gold nanoparticles to deliver sirna to improve plant resistance to Pseudomonas syringae. J Nanobiotechnol. 22 (1), 446 (2024).
  25. Laisney, J., Loczenski Rose, V., Watters, K., Donohue, K. V., Unrine, J. M. Delivery of short hairpin rna in the neotropical brown stink bug, Euschistus heros, using a composite nanomaterial. Pestic Biochem Physiol. 177, 104906 (2021).
  26. Terenius, O., et al. Rna interference in Lepidoptera: An overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. J Insect Physiol. 57 (2), 231-245 (2011).
  27. Kolge, H., Kadam, K., Ghormade, V. Chitosan nanocarriers mediated dsrna delivery in gene silencing for Helicoverpa armigera biocontrol. Pestic Biochem Physiol. 189, 105292 (2023).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Larva RNA Etkile imiBombyx MoriKitosan dsRNA Nanopartik lleriift Sarmall RNA dsRNAGen Fonksiyonel al masLepidoptera Model B cekRNAi Teknikleripekb ce i Larva BeslemeGenetik SistemS n f i Ara t rma Kat l m

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır