Chitosan/dsRNAナノ粒子送達によるカイコ Bombyx mori の幼虫RNA干渉

要約

ここで紹介するのは、カイコ Bombyx mori 幼虫にキトサン/dsRNAナノ粒子を送達し、摂取を通じて遺伝子サイレンシングを誘導するためのプロトコルです。

要約

カイコ、 Bombyx moriは、中国で数千年の歴史を持つ重要な経済昆虫です。一方、カイコは鱗翅目のモデル昆虫であり、基礎研究の蓄積が良好です。また、鱗翅目では初めての昆虫であり、完全なゲノムの配列が解読され、組み立てられており、遺伝子機能研究の強固な基盤となっています。RNAインターフェアレンス(RNAi)は、逆遺伝子機能研究に広く使用されていますが、カイコや他の鱗翅目種では難治性です。これまでに成功した二本鎖RNA(dsRNA)のRNAi関連研究は、注射のみで行われていました。給餌によるdsRNAの送達は報告されません。この記事では、摂取によってカイコの幼虫に供給されるキトサン/ dsRNAナノ粒子を調製するための段階的な手順について説明します。プロトコルは、(i)カイコの幼虫の適切なステージの選択、(ii)dsRNAの合成、(iii)キトサン/dsRNAナノ粒子の調製、および(iv)カイコの幼虫にキトサン/dsRNAナノ粒子を供給することを含む。代表的な結果として、遺伝子転写産物の確認や表現型の観察などを行っています。dsRNAフィーディングは、カイコの幼虫のRNAiの簡単な手法です。カイコの幼虫は飼育が簡単で、操作するのに十分な大きさであるため、昆虫の幼虫のRNAiを示すのに適したモデルを提供します。さらに、この手法のシンプルさは、研究への学生の関与を刺激し、カイコの幼虫を教室で使用するための理想的な遺伝システムにします。

概要

カイコ、 Bombyx moriは、5000年以上前に中国で家畜化された昆虫です。カイコは絹を生産する能力があるため、中国の農業と養蚕における重要な経済的昆虫です。カイコはショウジョウバエに次いでモデル昆虫です。鱗翅目のモデル昆虫として、カイコは飼育が容易で、体のサイズが大きく、変異体が豊富です。一方、カイコは、完全なゲノム配列が決定された最初の鱗翅目昆虫です¹。また、ゲノム²、トランスクリプトーム³、発現配列タグ(EST)⁴、ノンコーディング^RNA5、マイクロサテライト⁶ などの情報を提供するデータベースも多数公開されています。上記の事実は、カイコを遺伝子研究の完璧なモデルにしています。

RNA干渉(RNAi)は、二本鎖RNA(dsRNA)分子が相補的なメッセンジャーRNA(mRNA)に結合してスライスし、標的遺伝子のサイレンシング効果を達成する細胞プロセスです。このメカニズムは、ウイルスの侵入を防御するために細菌に自然に存在します^7。その後、RNAiは動物、植物、微生物に保存されていることがわかりました。RNAiは、その強力な配列特異的サイレンシング効果により、遺伝子発現の操作や遺伝子機能の研究などの基礎研究に利用されています。RNAiは、dsRNAを細胞に送達することによって達成されます。

昆虫では、dsRNAを送達する3つの一般的な方法があり、それはマイクロインジェクション、摂食、および浸漬^である8。現時点では、裸のdsRNA送達によるカイコのRNAi報告の成功は、dsRNA注射⁹によって行われている。マイクロインジェクションの利点は、dsRNAを血リンパに即座に送達し、dsRNAの量を正確に制御できることです。ただし、マイクロインジェクションには特定の欠点もあります。たとえば、時間がかかり、繊細なデバイスが必要です。また、注射針、注入量、dsRNA量の最適化も重要です。したがって、カイコにdsRNAを送達する別の方法が必要になります。昆虫の外骨格はキチン質でできた水密バリアであるため、昆虫の幼虫を浸してRNAiを達成することはめったに報告されず、昆虫のRNAiには適していません。dsRNAの供給は、省力化され、費用対効果が高く、簡単に実行できます¹⁰。この方法は、ハイスループット遺伝子スクリーニング¹¹にも適用できます。しかし、DNA/RNA非特異的ヌクレアーゼ、すなわちBmdsRNaseが、カイコ幼虫の中腸および中腸汁中腸中部ジュースに存在することがわかった¹²。このヌクレアーゼは、dsRNA、好ましく^は13を消化することが示されています。したがって、カイコに裸のdsRNAを与えて遺伝子発現を抑制することは困難であると思われます。

最近、ナノ粒子で保護されたdsRNAは、¹⁴を供給することによってRNAi効率を高めるための優れた代替手段であることが証明されています。キトサンは、安価で、無毒で、生分解性のポリマーであり、セルロース¹⁵に次いで天然に存在する2番目に豊富な生体高分子であるキチンの脱アセチル化によって調製できます。キトサンのアミノ基は正に帯電しており、dsRNAの骨格上のリン酸基は負に帯電しているため、キトサン/dsRNAナノ粒子はポリカチオンの自己組織化によって形成され得る¹⁶。キトサン/dsRNAナノ粒子は、蚊の Aedes aegypti および Anopheles gambiae¹⁷、ワタ斑点のあるボロワーム Earias vittella¹⁸ 、およびカーマインクモダニ Tetranychus cinnabarinus¹⁹の幼虫の摂食を通じてRNAiを達成するのに効果的です。

カイコに餌を与えてRNAi効率を高めるdsRNA送達の方法論を開発するために、このレポートは、キトサン/ dsRNAナノ粒子を調製し、ナノ粒子をカイコの幼虫に供給する方法に関する段階的な手順を説明することに焦点を当てています。この方法論は、比較的安価で省力化され、簡単に理解できるため、他の昆虫の遺伝子サイレンシング研究にも適応できます。私たちは、より高いRNAi効率で鱗翅目dsRNA導入法のより簡単なプロトコルを提供することを目指しています。

プロトコル

1.カイコの種と飼育

1. B. mori P50株の孵化したばかりの^1st instarカイコの幼虫を少なくとも120匹飼育し、新鮮な桑の葉を25 ± 1°C、日長12時間、明暗:12時間暗く、相対湿度75%±5%で飼育します。

2.カイコの幼虫の選択

1. RNAi実験のために5^番目の 幼虫の1日目を選びます。カイコの幼虫は、5^番目の インスターの3日目以降に急速に成長するため、幼虫の外観の違いを比較するのに理想的です。
   注:あるいは、3^番目 または4^番目の インスターなどの若いステージをRNAi実験に使用することもできます。ただし、5^番目の インスターまで一定のdsRNA処理が必要であり、これは比較的高価で材料費がかかります。

3. dsRNAの合成

1. dsRNA標的フラグメントの同定:標的遺伝子のコード配列を選択し、それを他の相同遺伝子と整列させて、保存された領域を決定します。非保存領域における遺伝子特異的プライマーを設計し、その後のdsRNA標的フラグメント増幅を行います。昆虫におけるRNAi実験の場合、典型的なdsRNA標的フラグメントは一般に400〜600 bpです。最小サイズは 200 bp です。
   注:RNAi実験の効率と成功率を向上させるために、dsRNA Engineer(https://dsrna-engineer.cn/)などのウェブベースのツールを使用してdsRNAターゲットを設計することができます。
2. PCR産物テンプレートの作成:T7 RNAポリメラーゼプロモーター(5'-TAATACGACTCACTATAGG-3')を上記で設計したいずれかのプライマーの5'末端に添加します。標準PCRを実施して、dsRNAターゲットフラグメントを増幅します。1% アガロースゲルを 1x TAE で泳動し、予想されるサイズの 1 つの PCR 産物を確認します。その後、PCR産物を精製キット(Table of Materials)で精製し、その後の転写に使用します。
   注:標的PCR産物を長期保存し、高収率を得るためには、PCR産物をプラスミドにライゲーションすることをお勧めします。プラスミドは、PCR反応の前に直鎖化する必要があります。
3. dsRNAの生成:T7 RNAiシステム(材料表)を使用してdsRNAを生成します。メーカーの指示に従って室温で成分を添加することにより、反応を設定します。ピペッティングで穏やかに反応液を混合し、37°Cで30分間インキュベートします。
   注:収量を最大化するために、37°Cでのインキュベーションを最大2〜6時間延長できます。二次構造またはGCリッチなテンプレートの場合、dsRNAの収量を改善するために、代わりに42°Cでインキュベーションを行うことができます。
4. アニーリングによるdsRNAの形成:反応を70°Cで10分間インキュベートした後、室温(~20分)までゆっくりと冷却します。これにより、dsRNAがアニーリングされます。
5. DNaseおよびRNase処理:供給したRNase溶液1μLをヌクレアーゼフリー水199μLにピペットで移し、新たに希釈したRNase溶液を調製します。反応容量20 μLあたり、新たに希釈したRNase溶液1 μLと付属のRQ1 RNaseフリーDNase溶液1 μLを加え、穏やかに混合し、37°Cで30分間インキュベートします。この処理後、反応中の一本鎖RNA(ssRNA)とテンプレートDNAは除去されます。
6. アルコール沈殿:反応に1容量のイソプロパノールまたは2.5容量の95%エタノールと0.1容量の3 M酢酸ナトリウム(pH 5.2)を加えます。ボルテックスで反応を混合し、氷上で5分間インキュベートして曇った塊を形成します。遠心分離機で最高速度で10分間回転し、チューブの底に白いペレットを回収します。上清を捨て、ペレットを0.5mLの冷たい70%エタノールで洗浄して、残留塩分を取り除きます。洗浄後、エタノールを取り除きます。ペレットを室温で15分間風乾させます。ペレットをヌクレアーゼフリー水で初期反応量の2〜5倍に再懸濁します。-20°Cまたは-70°Cで保存してください。
   注:dsRNAペレットは、完全に再懸濁するのが困難になる可能性があるため、過度に乾燥させないでください。十分な再懸濁を確保するには、最低2容量が必要です。
7. dsRNAの量と質のチェック:dsRNAをヌクレアーゼフリー水で1:100から1:300の比率で希釈します。製造元の指示に従って、微量分光光度計(Table of Materials)を使用してdsRNAの濃度を決定します。dsRNAを定量するには、濃度に体積を掛けます。dsRNAの品質を評価するには、アガロースゲル電気泳動を使用します。1% アガロースゲルを 1x TAE で調製し、dsRNA をヌクレアーゼフリー水で 1:50 に希釈します。レーンあたり5 μLの希釈dsRNAを使用し、0.5 mg/mLのエチジウムブロマイドでゲルを少なくとも15分間染色して視覚化します。
   注:dsRNAはdsDNAよりもゆっくりと移動します。

4. キトサン/dsRNAナノ粒子の調製

1. 100 mM 酢酸ナトリウム(0.1 M NaC₂H₃O₂ および 0.1 M 酢酸、脱イオン水中の pH 4.5)と 100 mM 硫酸ナトリウム(脱イオン水中の 100 mM Na₂SO₄ )バッファーを室温で作製します。
2. 商品化されたキトサン(エビの殻から、≥75%脱アセチル化; 資料表)100 mM酢酸ナトリウムバッファーで0.02%(w / v)キトサン溶液を作製します。
3. 20 μgのdsRNAを50 μLのヌクレアーゼフリー水に溶解し、50 μLの100 mM硫酸ナトリウムバッファーに加えて、100 μLのdsRNA溶液を調製します。
4. 100 μLのキトサン溶液を100 μLのdsRNA溶液に加えます。同時に、100 μLのキトサン溶液を100 μLの50 mM硫酸ナトリウムに加えてコントロールを調製します。混合物を混合し、55°Cで1分間加熱します。
5. 混合物を直ちに高速ボルテックスで30秒間ボルテックスし、ナノ粒子の形成を可能にします。
6. 混合物を室温で13,000 x g で10分間遠心分離し、白色ペレットを得ます。上清を新しい1.5mLチューブに移します。ペレットを室温で10分間風乾させます。
7. 微量分光光度計(Table of Materials)を使用して、上清中のdsRNAの濃度を決定します。コントロールの上清をブランクとして使用します。濃度に体積を掛けて、上清に残っているdsRNAの総量を計算します。ナノ粒子にカプセル化されたdsRNAの割合を、上清に残っている量をdsRNAの開始量で割った値で計算します。
   注:ナノ粒子は、使用¹⁴の前に少なくとも15日間4〜37°C保持することができますが、できるだけ早くナノ粒子を使用することをお勧めします。

5. カイコの幼虫にキトサン/dsRNAナノ粒子を与える

1. 摂食実験のために、同じサイズの脱皮したばかりの5^番目の インスターカイコの幼虫(つまり、5^番目の インスターの1日目)を選びます。幼虫を6ウェルプレートの各ウェルに個別に入れてから、カバーを閉じて24時間飢餓状態にします。
2. 新鮮な桑の葉を脱イオン水ですすぎ、きれいなキッチンペーパーで乾かします。桑の葉は水滴なしで乾燥しているべきです。1 cm x 1 cmの桑の葉の円盤にカットします。
3. 使用前に、キトサン/dsRNAナノ粒子をヌクレアーゼフリー水に500 ng/μLで溶解してください。コントロールキトサンナノ粒子(4.4で調製)を同量のヌクレアーゼフリー水で希釈します。ヌーキッドdsRNAをヌクレアーゼフリー水で500 ng/μLに調製します。
4. RNAiノックダウン実験用のキトサン/dsRNAナノ粒子を、ブランク/ネガティブコントロールとして制御キトサンナノ粒子を使用します。ネイキッドdsRNAを使用して、キトサン/dsRNAナノ粒子との違いを比較します。
5. 各葉板の表面に、キトサン/dsRNAナノ粒子、キトサン、およびネイキッドdsRNAをそれぞれ10 μLコーティングします。ナノ粒子溶液とdsRNA溶液を葉板上に室温で5分間風乾します。
6. 各幼虫に、1日あたり1つのナノ粒子コーティングまたはdsRNAコーティングされた葉の円盤を与えます。ナノ粒子被覆またはdsRNA被覆葉円盤を幼虫に5日間連続して提供します。コーティングされた葉の円盤が毎日幼虫によって完全に食べられた後、新鮮な桑の葉を提供することができます。
7. 6日目に、幼虫が動かなくなるまで氷の上で麻酔をかけ、幼虫を解剖してサンプリングします。きれいなペトリ皿の上でハサミで胸部を切り取ります。ピンセットで中腸を引き抜きます。中腸の中身を取り除き、ヌクレアーゼを含まない水で満たされた別のペトリ皿で中腸を洗います。中腸を1.5mLのチューブに保管し、-70°Cに保ちます。

6. 遺伝子サイレンシングの確認

1. 定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)を実施して、相対転写産物の定量を計算します。各生物学的複製に対して、少なくとも 3 回の生物学的複製と 3 回の技術的複製が必要です。相対転写産物を正常化するためには、少なくとも2つの参照遺伝子が推奨されます。 Bombyx Toll9-2 (BmToll9-2) 遺伝子を検査します。相対転写産物の平均値を対照群と比較し、それをパーセンテージに変換することにより、遺伝子サイレンシング効率を評価します。
   注:qRT-PCR増幅条件、プライマー情報、および相対転写産物の計算は、最近の出版物²⁰に記載されています。
2. RNAi表現型を解析して、遺伝子サイレンシング効果を評価します。幼虫と繭のサイズを観察します。毎日写真を撮って、外観を記録します。
   注:RNAiは、形態、変態、生理機能、および行動に影響を与える可能性があります。RNAi関連の表現型の観察は、標的とする遺伝子に依存します。

結果

RNAiの効率を評価するために、 BmToll9-2 を標的とする免疫遺伝子を解析用に選択しました。 BmToll9-2 遺伝子は研究室で十分に特徴付けられており、dsRNA注入による遺伝子サイレンシングにより、最近の論文²⁰で幼虫が軽くて小さくなります。キトサン/dsRNAナノ粒子による摂取によるRNAiの有効性を確認するため、キトサンナノ粒子をコント?...

ディスカッション

RNAi表現型の観察には、標的とする遺伝子に応じて、適切なステージが重要です。私たちの予備的な結果は、 Toll9-2 がカイコの成長に関与していることを示しました。カイコの幼虫のサイズと重量は、5^番目の イン^スター21で急速に増加します。したがって、5^番目の 幼虫は、キトサン/dsRNAナノ粒子供給実験のステージとして選?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tube	Sangon	F601620	for dsRNA or nanoparticles reaction
10 μl pipette	Eppendorf	P13473G	to aspirate or resuspend liquid
100 μl pipette	Eppendorf	Q12115G	to aspirate or resuspend liquid
2.5 μl pipette	Eppendorf	P20777G	to aspirate or resuspend liquid
20 μl pipette	Eppendorf	H19229E	to aspirate or resuspend liquid
200 μl pipette	Eppendorf	H20588E	to aspirate or resuspend liquid
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Costar	3516	for silkworm rearing individually
Acetic acid	Aladdin	A116165	to make TAE
Agarose M	BBI Life Sciences	A610013	for agarose gel electrophosis
Analytical balance	Sartorius	BSA224S	to weight ingredients
Centrifuge	Sartorius	Centrisart A-14C	to centrifuge to form dsRNA or nanoparticles
Chitosan	Sigma-Aldrich	C3646	to combine with dsRNA for preparation of nanoparticles
EDTA	Sangon	A500895	to make TAE
Ethanol	Aladdin	E130059	to make TAE, or for dsRNA precipitation
Freezer	Siemens	iQ300	to store dsRNA or nanoparticles
GoTaq Green Master Mix	Promega	M712	for PCR reaction
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6002	for qRT-PCR reaction
Isopropanol	Aladdin	I112011	for dsRNA precipitation
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher	One	to determine the concentration of dsRNA
ph meter	Sartorius	PB-10	to prepare buffers
SanPrep Column PCR Product Purification Kit	Sangon	B518141	for PCR product purification
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889	to make 100 mM sodium acetate buffer
Sodium sulfate	Sigma-Aldrich	239313	to make 100 mM sodium sulfate buffer
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	for dsRNA synthesis
ThermoMixer	Eppendorf	C	for dsRNA generation or nanoparticles heating
Tris	Sangon	A501492	to make TAE
Vortex	IKA	Vortex 3	to prepare chitosan/dsRNA nanoparticles