התערבות RNA זחל בתולעי משי Bombyx mori באמצעות Chitosan/dsRNA אספקת ננו-חלקיקים

Summary

מוצג כאן פרוטוקול להעברת ננו-חלקיקים chitosan/dsRNA בזחלי בומביקס מורי תולעי משי כדי לגרום להשתקת גנים באמצעות בליעה.

Abstract

תולעת המשי, Bombyx mori, היא חרק כלכלי חשוב עם אלפי שנות היסטוריה בסין. בינתיים, תולעת המשי היא חרק מודל של Lepidoptera עם הצטברות טובה של מחקר בסיסי. זהו גם החרק הראשון בלפידופטרה, שהגנום המלא שלו רוצף והורכב, מה שמספק בסיס מוצק למחקר תפקודי גנים. אף על פי שהתערבות RNA (RNAi) נמצאת בשימוש נרחב במחקר פונקציונלי של גנים הפוכים, היא עמידה בתולעי משי ובמינים אחרים של לפידופטרנים. מחקר מוצלח קודם הקשור ל-RNAi להעברת RNA דו-גדילי (dsRNA) בוצע באמצעות הזרקה בלבד. אספקת dsRNA באמצעות הזנה לעולם אינה מדווחת. במאמר זה, אנו מתארים הליכים שלב אחר שלב להכנת חלקיקי chitosan/dsRNA, אשר מוזנים לזחלי תולעי המשי על ידי בליעה. הפרוטוקול כולל (i) בחירת השלב הנכון של זחלי תולעי משי, (ii) סינתזה של dsRNA, (iii) הכנת ננו-חלקיקי chitosan/dsRNA, ו-(iv) הזנת זחלי תולעי המשי בננו-חלקיקים chitosan/dsRNA. מוצגות תוצאות מייצגות, כולל אישור שעתוק גנים ותצפית פנוטיפית. הזנת dsRNA היא טכניקה פשוטה עבור RNAi בזחלי תולעי משי. מכיוון שזחלי תולעי משי קלים לגידול וגדולים מספיק לתפעול, הוא מספק מודל טוב להדגמת RNAi זחל בחרקים. בנוסף, הפשטות של טכניקה זו מעוררת מעורבות רבה יותר של התלמידים במחקר, מה שהופך את זחלי תולעי המשי למערכת גנטית אידיאלית לשימוש במסגרת כיתתית.

Introduction

תולעת המשי, Bombyx mori, היא חרק מבוית לפני יותר מ -5000 שנה בסין. בשל יכולתה לייצר משי, תולעת המשי היא חרק כלכלי חשוב בחקלאות ובחקלאות הסינית. תולעת המשי שנייה רק לזבוב הפירות כחרק המודל. כחרק מודל בלפידופטרה, תולעת המשי קלה לגידול, עם גודל גוף גדול והרבה מוטנטים. בינתיים, תולעת המשי היא החרק הלפידופטרני הראשון שהגנום המלא שלו מרוצף¹. מאגרי מידע רבים המספקים מידע עבור גנום², שעתוק³, תג רצף מבוטא (EST)⁴,^{RNA 5} שאינו מקודד ומיקרו-לוויין⁶ זמינים גם הם לציבור. העובדות הנ"ל הופכות את תולעת המשי למודל מושלם למחקר גנטי.

RNA interference (RNAi) הוא תהליך תאי שבו מולקולות RNA דו-גדילי (dsRNA) נקשרות ופורסות את הרנ"א השליח המשלים (mRNA), ובכך משיגות את אפקט ההשתקה של גן המטרה. מנגנון זה קיים באופן טבעי בחיידקים כדי להגן מפני פלישת וירוסים⁷. מאוחר יותר נמצא כי RNAi נשמר בבעלי חיים, צמחים ומיקרובים. בשל אפקט ההשתקה הספציפי לרצף החזק שלו, RNAi משמש במחקר בסיסי כדי לתפעל ביטוי גנים ולחקור תפקוד גנים. RNAi מושג באמצעות העברת dsRNA לתוך תאים.

בחרקים, ישנן שלוש דרכים נפוצות להעביר dsRNA, שהן מיקרו-הזרקה, האכלה והשריה⁸. כרגע, דיווחי RNAi מוצלחים בתולעי המשי באמצעות משלוח dsRNA עירום מתבצעים על ידי הזרקת dsRNA⁹. היתרונות של מיקרו-הזרקה הם העברה מיידית של dsRNA לתוך ההמולימפה ובקרת כמות dsRNA מדויקת. עם זאת, קיימים גם חסרונות מסוימים של מיקרו-הזרקה. לדוגמה, זה זמן רב, וזה דורש מכשירים עדינים. חשוב גם לייעל את מחטי ההזרקה, נפח ההזרקה וכמות ה-dsRNA. לכן, יש צורך בדרך חלופית להעביר dsRNA לתולעי משי. מכיוון שהשלד החיצוני של חרק הוא מחסום אטום למים העשוי מכיטין, כמעט ולא מדווחים על השריית זחלי חרקים להשגת RNAi, וזו אינה אפשרות טובה עבור RNAi בחרקים. הזנת dsRNA חוסכת עבודה, חסכונית וקלה לביצוע¹⁰. שיטה זו ישימה גם לבדיקת גנים בתפוקה גבוהה¹¹. עם זאת, נמצא כי נוקלאז לא ספציפי של DNA/RNA, כלומר BmdsRNase, נמצא במיץ אמצע המעי ואמצע המעיים של זחלי תולעי המשי¹². נוקלאז זה מוצג לעיכול dsRNA, רצוי¹³. לכן, הזנת dsRNA עירום לתולעת המשי כדי להשתיק את ביטוי הגן נראית קשה.

לאחרונה, dsRNA מוגן ננו-חלקיקים הוכח כחלופה טובה להגברת יעילות ה-RNAi על ידי הזנת¹⁴. צ'יטוזן הוא פולימר זול, לא רעיל ומתכלה, שניתן להכין על ידי דה-אצטילציה של כיטין, ביופולימר טבעי והשני בשכיחותו אחרי תאית¹⁵. מכיוון שקבוצת האמינו בצ'יטוזן טעונה חיובית וקבוצת הפוספט בעמוד השדרה של ה-dsRNA טעונה שלילית, ננו-חלקיקי הכיטוסן/dsRNA יכולים להיווצר על ידי הרכבה עצמית של פוליקטונים¹⁶. ננו-חלקיקי Chitosan/dsRNA יעילים בהשגת RNAi באמצעות הזנת זחלים ביתושים Aedes aegypti ו-Anopheles gambiae¹⁷, תולעת כותנה מנומרת Earias vittella¹⁸ וקרדית עכביש קרמין Tetranychus cinnabarinus¹⁹.

על מנת לפתח מתודולוגיה להעברת dsRNA על ידי הזנה בתולעי משי כדי להשיג יעילות RNAi מוצלחת, דוח זה מתמקד בתיאור הליכים שלב אחר שלב כיצד להכין את חלקיקי הצ'יטוזן/dsRNA ולהזין את הננו-חלקיקים לזחלי תולעי המשי. מתודולוגיה זו זולה יחסית, חוסכת עבודה וקלה לביצוע, וניתן להתאים אותה למחקרי השתקת גנים בחרקים אחרים. אנו שואפים לספק פרוטוקול קל יותר עבור שיטת העברת dsRNA Lepidopteran עם יעילות RNAi גבוהה יותר.

Protocol

1. מיני תולעי משי וגידול

1. מאחור לפחות 120 זחלי תולעי משי^{1st st} בקעו טריים מזן B. mori P50 עם עלי תות טריים ב 25 ± 1 °C, photoperiod 12 שעות אור: 12 שעות כהה, ו 75% ± 5% לחות יחסית.

2. בחירת זחלי תולעי משי

1. בחרו את היום הראשון מתוך זחלי הכוכב^החמישי לניסוי ה-RNAi; זחלי תולעי המשי גדלים מהר לאחר היום השלישי של הכוכב^החמישי , שהוא אידיאלי להשוואת ההבדלים במראה הזחל.
   הערה: לחלופין, שלבים צעירים יותר, כגון הכוכב^השלישי או^הרביעי , יכולים לשמש לניסוי RNAi. עם זאת, הוא דורש טיפול קבוע ב- dsRNA עד הכוכב^החמישי , שהוא יקר יחסית ועולה חומר.

3. סינתזה של dsRNA

1. זיהוי מקטע יעד dsRNA: בחר את רצף הקידוד של גן מטרה ויישר אותו עם גנים הומולוגיים אחרים כדי לקבוע את האזור השמור. תכננו פריימרים ספציפיים לגן באזור הלא שמור עבור הגברה עוקבת של מקטע המטרה dsRNA. עבור ניסויי RNAi בחרקים, מקטע המטרה הטיפוסי של dsRNA הוא בדרך כלל 400-600 bp. הגודל המינימלי יכול להיות 200 bp.
   הערה: כדי לשפר את היעילות ואת הקצב המוצלח של ניסויי RNAi, ניתן להשתמש בכלי מבוסס אינטרנט כלשהו כדי לתכנן את יעד dsRNA, כגון dsRNA Engineer (https://dsrna-engineer.cn/).
2. הפקת תבנית מוצר PCR: הוסף מקדם T7 RNA פולימראז (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3') לקצה 5' של כל פריימר שתוכנן לעיל. בצע PCR סטנדרטי כדי להגביר את מקטע היעד dsRNA. הפעל ג'ל אגרוז 1% ב- 1x TAE כדי לאמת מוצר PCR יחיד בגודל הצפוי. לאחר מכן, לטהר את מוצר PCR עם ערכת טיהור (טבלה של חומרים) ולהשתמש בו לתמלול הבא.
   הערה: כדי לאחסן את מוצר היעד PCR לטווח ארוך ולקבל תשואות גבוהות, מומלץ לקשור את מוצר ה- PCR לפלסמיד. פלסמיד צריך להיות ליניארי לפני תגובת PCR.
3. יצירת dsRNA: השתמש במערכת T7 RNAi (רשימת חומרים) כדי ליצור את dsRNA. הגדר את התגובה על ידי הוספת הרכיבים בטמפרטורת החדר בהתאם להוראות היצרן. מערבבים את התגובה על ידי פיפטינג עדין ודגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
   הערה: כדי למקסם את התפוקה, הדגירה ב 37 ° C ניתן להאריך עד 2-6 שעות. עבור תבניות המכילות מבנה משני או עשיר ב-GC, ניתן לבצע דגירה ב-42°C במקום זאת כדי לשפר את התפוקה של dsRNA.
4. חישול ליצירת dsRNA: יש לדגור על התגובה בטמפרטורה של 70°C למשך 10 דקות, ואז לקרר לאט לטמפרטורת החדר (~20 דקות). זה יבטל את ה-dsRNA.
5. טיפול DNase ו- RNase: פיפטה 1 μL של תמיסת RNase שסופקה ל 199 μL של מים ללא nuclease כדי ליצור תמיסת RNase מדוללת טרייה. הוסף 1 μL של תמיסת RNase מדוללת טרייה ו- 1 μL של DNase ללא RQ1 RNase המסופק לכל נפח תגובה של 20 μL, ערבב בעדינות ודגר ב- 37 ° C למשך 30 דקות. הרנ"א החד-גדילי (ssRNA) והדנ"א התבנית בתגובה יוסרו לאחר טיפול זה.
6. משקעים אלכוהוליים: הוסף נפח אחד של איזופרופנול או 2.5 כרכים של 95% אתנול יחד עם נפח 0.1 של 3 M נתרן אצטט (pH 5.2) לתגובה. מערבבים את התגובה על ידי מערבולות ודגרים על קרח במשך 5 דקות ליצירת מסה מעוננת. מסתובבים במהירות מרבית בצנטריפוגה במשך 10 דקות כדי לאסוף גלולה לבנה בתחתית הצינור. השליכו את הסופרנאטנט ושטפו את הגלולה עם 0.5 מ"ל אתנול קר 70% כדי להסיר את שאריות המלח. מוציאים את האתנול לאחר הכביסה. הניחו לגלולה להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. השהה מחדש את הגלולה עם מים נטולי נוקלאז פי 2-5 מנפח התגובה הראשונית. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C או -70°C.
   הערה: כדורי dsRNA לא צריכים להיות מיובשים יתר על המידה, שכן זה יכול להקשות על השעיה מלאה. כדי להבטיח השעיה מספקת, יש צורך במינימום של 2 כרכים.
7. בדיקת כמות ואיכות של dsRNA: לדלל את ה-dsRNA במים נטולי נוקלאז ביחס של 1:100 עד 1:300. לקבוע את ריכוז dsRNA באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח (טבלה של חומרים) בהתאם להוראות היצרן. כדי לכמת dsRNA, הכפילו את הריכוז בנפח. כדי להעריך את איכות dsRNA, השתמש אלקטרופורזה ג'ל agarose. הכינו ג'ל אגרוז 1% ב-1x TAE ודללו את ה-dsRNA בשעה 1:50 במים נטולי נוקלאז. יש להשתמש ב-5 μL של dsRNA מדולל לכל נתיב ולהכתים את הג'ל ב-0.5 מ"ג/מ"ל אתידיום ברומיד למשך 15 דקות לפחות לצורך הדמיה.
   הערה: dsRNA נודד לאט יותר מאשר dsDNA.

4. הכנת ננו-חלקיקי chitosan/dsRNA

1. הפוך 100 mM נתרן אצטט (0.1 M NaC₂H₃O₂ ו 0.1 M חומצה אצטית, pH 4.5 במים deionized) ו 100 mM נתרן סולפט (100 mM Na₂SO₄ במים deionized) חיץ בטמפרטורת החדר.
2. להמיס צ'יטוזן ממוסחר (מקליפות שרימפס, ≥75% deacetylated; טבלת חומרים) ב 100 mM נתרן אצטט מאגר כדי להפוך 0.02% (w / v) chitosan פתרון.
3. להמיס 20 מיקרוגרם של dsRNA ב 50 μL של מים נטולי nuclease ולהוסיף אותו 50 μL של 100 mM נתרן סולפט חיץ כדי ליצור 100 μL dsRNA פתרון.
4. הוסף 100 μL של תמיסת chitosan ל 100 μL של תמיסת dsRNA. במקביל, להכין בקרה על ידי הוספת 100 μL של תמיסת chitosan ל 100 μL של 50 mM נתרן גופרתי. מערבבים ומחממים את התערובות ב-55°C למשך דקה אחת.
5. מערבלים את התערובת מיד עם מערבולת במהירות גבוהה במשך 30 שניות כדי לאפשר היווצרות של ננו-חלקיקים.
6. צנטריפוגה את התערובת ב 13,000 x גרם בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות כדי לקבל גלולה לבנה. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור טרי בנפח 1.5 מ"ל. תנו לגלולה להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
7. לקבוע את ריכוז dsRNA בסופרנאטנט באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח (טבלה של חומרים). השתמש ב- supernatant מהפקד כ- blank. הכפל את הריכוז בנפח כדי לחשב את הכמות הכוללת של dsRNA שנותרה בסופרנטנט. חשב את אחוז ה-dsRNA העטוף בננו-חלקיקים בכמות שנותרה בסופרנאטנט חלקי הכמות ההתחלתית של dsRNA.
   הערה: למרות שניתן לשמור את הננו-חלקיקים במשך 4-37 מעלות צלזיוס לפחות 15 יום לפני השימוש¹⁴, מומלץ להשתמש בננו-חלקיקים בהקדם האפשרי.

5. הזנת זחלי תולעי המשי בננו-חלקיקים chitosan/dsRNA

1. בחרו זחלי תולעי משי^מותכים טריים (כלומר, יום 1 של הכוכב^החמישי ) באותו גודל לניסוי ההאכלה. מניחים את הזחלים בנפרד לתוך כל באר של צלחת 6 בארות לפני סגירת הכיסוי ורעב במשך 24 שעות.
2. שטפו עלי תות טריים במים נטולי יונים, וייבשו אותם בנייר מטבח נקי. עלי התות צריכים להיות יבשים ללא טיפות מים. חותכים לדיסקיות עלי תות בגודל 1 ס"מ על 1 ס"מ.
3. יש להמיס ננו-חלקיקי chitosan/dsRNA במים נטולי נוקלאז ב-500 ננוגרם/μL לפני השימוש. לדלל את חלקיקי chitosan הבקרה (מוכן ב 4.4) עם אותו נפח של מים נטולי nuclease. הכינו dsRNA עירומים ל-500 ננוגרם/מיקרוליטר במים נטולי נוקלאז.
4. השתמש בננו-חלקיקי chitosan/dsRNA לניסוי הפלה של RNAi, ננו-חלקיקי צ'יטוזן הבקרה כבקרה ריקה/שלילית. השתמש ב- dsRNA העירום כדי להשוות את ההבדלים עם חלקיקי chitosan/dsRNA.
5. ציפוי 10 μL של חלקיקי chitosan/dsRNA, chitosan, ו- dsRNA עירום על פני השטח של כל דיסקת עלה, בהתאמה. יבשו באוויר את תמיסת הננו-חלקיקים ותמיסת dsRNA על דיסקיות העלה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
6. האכילו כל זחל בדיסק עלים אחד מצופה ננו-חלקיקים או dsRNA ליום. ספק דיסקיות עלים מצופות ננו-חלקיקים או dsRNA לזחלים ברציפות במשך 5 ימים. ניתן לספק עלי תות טריים לאחר שדיסקית העלים המצופה נאכלת במלואה על ידי הזחלים בכל יום.
7. ביום 6, מרדימים את הזחלים על קרח עד שהם לא זזים ומנתחים את הזחלים לדגימה. חותכים את בית החזה עם מספריים על צלחת פטרי נקייה. שלפו את הבטן האמצעית עם טוויטר. מוציאים את התוכן במרכז המעי ושוטפים את המעי בצלחת פטרי אחרת מלאה במים נטולי נוקלאז. יש לאחסן את המעי התיכון בצינור של 1.5 מ"ל ולשמור בטמפרטורה של -70°C.

6. אישור השתקת גנים

1. בצע PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR) כדי לחשב את כימות התמליל היחסי. נדרשים לפחות שלושה משכפלים ביולוגיים ושלושה שכפולים טכניים לכל שכפול ביולוגי. מומלץ לפחות שני גני ייחוס כדי לנרמל את התעתיק היחסי. הגן Bombyx Toll9-2 (BmToll9-2) נבדק. להעריך את יעילות השתקת הגן על ידי השוואת הערך הממוצע של התמליל היחסי לקבוצת הביקורת ולהמיר אותו לאחוזים.
   הערה: ניתן למצוא את תנאי הגברה qRT-PCR, מידע פריימר וחישוב תמלול יחסי בפרסום האחרון שלנו²⁰.
2. לנתח את הפנוטיפ RNAi כדי להעריך את אפקט השתקת הגנים. שימו לב לגודל הזחלים והפקעות. צלם תמונות מדי יום כדי להקליט הופעות.
   הערה: RNAi יכול להשפיע על מורפולוגיה, מטמורפוזה, פיזיולוגיה והתנהגות. התצפית של פנוטיפים הקשורים ל-RNAi תלויה בגנים הממוקדים.

תוצאות

כדי להעריך את יעילות ה-RNAi, נבחר לניתוח גן חיסוני המכוון ל-BmToll9-2 . הגן BmToll9-2 מאופיין היטב במעבדה, והשתקת גנים על ידי הזרקת dsRNA גורמת לזחלים קלים וקטנים יותר בפרסום האחרון שלנו²⁰. כדי לאשר את יעילות ה-RNAi על ידי בליעה באמצעות ננו-חלקיקי chitosan/dsRNA, ננו-חלקיקי ...

Discussion

שלב נכון חשוב לתצפית פנוטיפ RNAi, בהתאם לגנים הממוקדים. התוצאות הראשוניות שלנו הראו כי Toll9-2 מעורב בגידול של תולעת המשי. גודלם ומשקלם של זחלי תולעי המשי גדלים במהירות בכוכב^{החמישי 21}. לכן, זחלי הכוכב^ה-5 נבחרים כשלב לניסוי הזנת ננו-חלקיקי chitosan/dsRNA. נ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tube	Sangon	F601620	for dsRNA or nanoparticles reaction
10 μl pipette	Eppendorf	P13473G	to aspirate or resuspend liquid
100 μl pipette	Eppendorf	Q12115G	to aspirate or resuspend liquid
2.5 μl pipette	Eppendorf	P20777G	to aspirate or resuspend liquid
20 μl pipette	Eppendorf	H19229E	to aspirate or resuspend liquid
200 μl pipette	Eppendorf	H20588E	to aspirate or resuspend liquid
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Costar	3516	for silkworm rearing individually
Acetic acid	Aladdin	A116165	to make TAE
Agarose M	BBI Life Sciences	A610013	for agarose gel electrophosis
Analytical balance	Sartorius	BSA224S	to weight ingredients
Centrifuge	Sartorius	Centrisart A-14C	to centrifuge to form dsRNA or nanoparticles
Chitosan	Sigma-Aldrich	C3646	to combine with dsRNA for preparation of nanoparticles
EDTA	Sangon	A500895	to make TAE
Ethanol	Aladdin	E130059	to make TAE, or for dsRNA precipitation
Freezer	Siemens	iQ300	to store dsRNA or nanoparticles
GoTaq Green Master Mix	Promega	M712	for PCR reaction
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6002	for qRT-PCR reaction
Isopropanol	Aladdin	I112011	for dsRNA precipitation
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher	One	to determine the concentration of dsRNA
ph meter	Sartorius	PB-10	to prepare buffers
SanPrep Column PCR Product Purification Kit	Sangon	B518141	for PCR product purification
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889	to make 100 mM sodium acetate buffer
Sodium sulfate	Sigma-Aldrich	239313	to make 100 mM sodium sulfate buffer
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	for dsRNA synthesis
ThermoMixer	Eppendorf	C	for dsRNA generation or nanoparticles heating
Tris	Sangon	A501492	to make TAE
Vortex	IKA	Vortex 3	to prepare chitosan/dsRNA nanoparticles