키토산/dsRNA 나노입자 전달을 통한 누에 Bombyx mori 의 유충 RNA 간섭

요약

여기에는 누에 Bombyx mori 유충에서 키토산/dsRNA 나노입자 전달을 통해 유전자 침묵을 유도하기 위한 프로토콜이 제시되어 있습니다.

초록

누에인 Bombyx mori는 중국에서 수천 년의 역사를 가진 중요한 경제적 곤충입니다. 한편, 누에는 기초 연구가 잘 축적된 나비목의 모델 곤충입니다. 또한 완전한 게놈 염기서열 분석 및 조립이 이루어진 나비목의 첫 번째 곤충으로 유전자 기능 연구를 위한 견고한 기반을 제공합니다. RNA 간섭(RNAi)은 역 유전자 기능 연구에 널리 사용되지만 누에 및 기타 나비목 종에서는 불응성입니다. 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 전달하기 위한 이전의 성공적인 RNAi 관련 연구는 주입을 통해서만 수행되었습니다. 수유를 통한 dsRNA의 전달은 보고된 적이 없습니다. 이 기사에서는 누에 유충에 섭취하여 공급되는 키토산/dsRNA 나노입자를 준비하는 단계별 절차를 설명합니다. 이 프로토콜에는 (i) 누에 유충의 적절한 단계 선택, (ii) dsRNA 합성, (iii) 키토산/dsRNA 나노입자 준비, (iv) 누에 유충에 키토산/dsRNA 나노입자 공급이 포함됩니다. 유전자 전사체 확인 및 표현형 관찰을 포함한 대표적인 결과를 제시합니다. dsRNA 섭식은 누에 유충의 RNAi를 위한 간단한 기술입니다. 누에 유충은 기르기 쉽고 활동할 수 있을 만큼 충분히 크기 때문에 곤충에서 유충 RNAi를 입증할 수 있는 좋은 모델을 제공합니다. 또한 이 기술의 단순성은 연구에 대한 더 많은 학생 참여를 자극하여 누에 유충을 교실 환경에서 사용하기에 이상적인 유전 시스템으로 만듭니다.

서문

누에인 Bombyx mori는 5000년 전에 중국에서 길들여진 곤충입니다. 실크를 생산하는 능력으로 인해 누에는 중국 농업 및 양잠에서 중요한 경제적 곤충입니다. 누에는 초파리 다음으로 모델 곤충으로 꼽힌다. 나비목의 모델 곤충인 누에는 키우기 쉽고 몸집이 크고 돌연변이가 많습니다. 한편, 누에는 완전한 게놈 염기서열¹을 가진 최초의 나비목 곤충입니다. 게놈², 전사체³, 발현된 서열 태그(EST)⁴, 비암호화 RNA⁵ 및 현미부수체⁶ 에 대한 정보를 제공하는 많은 데이터베이스도 일반에 공개되어 있습니다. 위의 사실들은 누에를 유전자 연구를 위한 완벽한 모델로 만든다.

RNA 간섭(RNAi)은 이중 가닥 RNA(dsRNA) 분자가 상보적 메신저 RNA(mRNA)와 결합하고 절단하여 표적 유전자의 침묵 효과를 달성하는 세포 과정입니다. 이 메커니즘은 바이러스의 침입을 방어하기 위해 박테리아에 자연적으로 존재한다⁷. 나중에 RNAi가 동물, 식물 및 미생물에서 보존된다는 것이 밝혀졌습니다. 강력한 염기서열 특이적 침묵 효과로 인해 RNAi는 유전자 발현을 조작하고 유전자 기능을 연구하기 위한 기초 연구에 사용됩니다. RNAi는 dsRNA를 세포에 전달함으로써 달성됩니다.

곤충에서 dsRNA를 전달하는 세 가지 일반적인 방법은 미세주입, 섭식, 담그기입니다⁸. 현재 누에에서 벌거벗은 dsRNA 전달을 통한 성공적인 RNAi 보고는 dsRNA 주입에 의해 수행되고^{있다 9}. 미세주입의 장점은 dsRNA를 혈림프에 즉시 전달하고 dsRNA 양을 정밀하게 제어할 수 있다는 것입니다. 그러나 미세 주입의 특정 단점도 존재합니다. 예를 들어, 시간이 많이 걸리고 섬세한 장치가 필요합니다. 주입 바늘, 주입 부피 및 dsRNA 양을 최적화하는 것도 중요합니다. 따라서 dsRNA를 누에에게 전달하는 대체 방법이 필요하게 되었습니다. 곤충의 외골격은 키틴으로 만들어진 수밀 장벽이기 때문에 RNAi를 얻기 위해 곤충 유충을 담그는 것은 거의 보고되지 않으며, 이는 곤충의 RNAi에 좋은 선택이 아닙니다. dsRNA의 공급은 노동력이 절약되고 비용 효율적이며 수행하기 쉽습니다¹⁰. 이 방법은 고처리량 유전자 스크리닝에도 적용할 수 있다¹¹. 그러나, DNA/RNA 비특이적 뉴클레아제, 즉 BmdsRNase가 누에 유충의 중장액과 중장액에 존재하는 것이 발견되었다¹². 이 뉴클레아제는 dsRNA, 바람직하게는¹³을 절단하는 것으로 나타났습니다. 따라서 누에에게 벌거벗은 dsRNA를 공급하여 유전자 발현을 침묵시키는 것은 어려운 것으로 보인다.

최근에는 nanoparticle-shielded dsRNA가¹⁴를 공급하여 RNAi 효율을 높일 수 있는 좋은 대안임이 입증되었습니다. 키토산은 저렴하고 독성이 없으며 생분해되는 고분자로, 자연적으로 발생하고 셀룰로오스¹⁵에 이어 두 번째로 풍부한 생체 고분자인 키틴의 탈아세틸화로 제조할 수 있습니다. 키토산의 아미노기는 양전하를 띠고 dsRNA의 골격에 있는 인산기는 음전하를 띠기 때문에 키토산/dsRNA 나노입자는 폴리케이션¹⁶의 자기 조립에 의해 형성될 수 있습니다. 키토산/dsRNA 나노입자는 이집트숲모기(Aedes aegypti)와 아노펠레스 감비아에(Anopheles gambiae) ¹⁷, 목화점박이볼웜(Earias vittella^{) 18}, 카민 거미 진드기(Tetranychus cinnabarinus) ¹⁹의 유충 먹이를 통해 RNAi를 달성하는 데 효과적입니다.

성공적인 RNAi 효율성을 얻기 위해 누에를 먹이로 하여 dsRNA를 전달하는 방법론을 개발하기 위해 이 보고서는 키토산/dsRNA 나노입자를 준비하고 나노입자를 누에 유충에 공급하는 방법에 대한 단계별 절차를 설명하는 데 중점을 둡니다. 이 방법론은 상대적으로 저렴하고 노동력이 절약되며 따르기 쉬우므로 다른 곤충의 유전자 침묵 연구에 적용할 수 있습니다. 우리는 더 높은 RNAi 효율성으로 Lepidopteran dsRNA 전달 방법을 위한 더 쉬운 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

1. 누에의 종과 사육

1. B. mori P50 균주의 갓 부화한^1st instar 누에 유충 최소 120 마리를 25 ± 1 °C, 광주기 12 시간 밝은 곳 : 12 시간 어둡고 75 % ± 5 % 상대 습도에서 신선한 뽕나무 잎을 가지고 있습니다.

2. 누에 유충의 선택

1. RNAi 실험을 위해 5^번째 instar 유충의 1일을 선택합니다. 누에 유충은 5^일 째 인스타의 3일째 이후에 빠르게 자라며, 이는 유충 모양의 차이를 비교하는 데 이상적입니다.
   참고: 또는 3^번째 또는 4^번째 instar와 같은 더 젊은 단계를 RNAi 실험에 사용할 수 있습니다. 그러나 5^번째 instar까지 지속적인 dsRNA 처리가 필요하기 때문에 상대적으로 비용이 많이 들고 재료비도 많이 듭니다.

3. dsRNA의 합성

1. dsRNA target fragment 식별: 타겟 유전자의 코딩 염기서열을 선택하고 다른 상동 유전자와 정렬하여 보존된 영역을 결정합니다. 후속 dsRNA 타겟 단편 증폭을 위해 보존되지 않은 영역에서 유전자 특이적 프라이머를 설계합니다. 곤충을 대상으로 한 RNAi 실험의 경우 일반적인 dsRNA 표적 단편은 일반적으로 400-600bp입니다. 최소 크기는 200bp일 수 있습니다.
   참고: RNAi 실험의 효율성과 성공률을 높이기 위해 dsRNA Engineer(https://dsrna-engineer.cn/)와 같은 일부 웹 기반 도구를 사용하여 dsRNA 표적을 설계할 수 있습니다.
2. PCR 제품 템플릿 생성: T7 RNA 중합효소 프로모터(5'-TAATACGACTCACTATAGG-3')를 위에서 설계된 프라이머의 5'-말단에 추가합니다. dsRNA target fragment를 증폭하기 위해 표준 PCR을 수행합니다. 1x TAE에서 1% 아가로스 겔을 실행하여 예상 크기의 단일 PCR 산물을 확인합니다. 그 후, 정제 키트(Table of Materials)로 PCR 산물을 정제하고 후속 전사에 사용합니다.
   참고: 타겟 PCR 산물을 장기간 보관하고 높은 수율을 얻으려면 PCR 산물을 플라스미드에 결찰하는 것이 좋습니다. 플라스미드는 PCR 반응 전에 선형화되어야 합니다.
3. dsRNA 생성: T7 RNAi 시스템(Table of Materials)을 사용하여 dsRNA를 생성합니다. 제조업체의 지침에 따라 실온에서 구성 요소를 추가하여 반응을 설정합니다. 피펫팅으로 반응을 부드럽게 혼합하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
   참고: 수율을 최대화하기 위해 37°C에서의 배양을 최대 2-6시간까지 연장할 수 있습니다. 2차 구조 또는 GC가 풍부한 template의 경우 dsRNA의 수율을 향상시키기 위해 42°C에서 배양을 수행할 수 있습니다.
4. dsRNA를 형성하기 위한 어닐링: 70°C에서 10분 동안 반응을 배양한 다음 실온(~20분)으로 천천히 냉각합니다. 이렇게 하면 dsRNA가 어닐링됩니다.
5. DNase 및 RNase 처리: 공급된 RNase 용액 1μL를 뉴클레아제가 없는 물 199μL에 피펫팅하여 새로 희석한 RNase 용액을 만듭니다. 20 μL 반응 부피당 1 μL의 갓 희석된 RNase 용액과 제공된 RQ1 RNase-free DNase 1 μL를 넣고 부드럽게 혼합한 후 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 반응에서 단일 가닥 RNA(ssRNA) 및 템플릿 DNA는 이 처리 후에 제거됩니다.
6. 알코올 침전: 이소프로판올 1부피 또는 95% 에탄올 2.5부피와 3M 아세트산나트륨(pH 5.2) 0.1부피를 반응에 첨가합니다. 소용돌이로 반응을 혼합하고 얼음 위에서 5분 동안 배양하여 탁한 덩어리를 형성합니다. 원심분리기에서 최대 속도로 10분 동안 회전하여 튜브 바닥에 흰색 펠릿을 수집합니다. 상층액을 버리고 펠릿을 0.5mL의 차가운 70% 에탄올로 세척하여 잔류 염을 제거합니다. 세척 후 에탄올을 제거하십시오. 펠릿을 실온에서 15분 동안 자연 건조시킵니다. 초기 반응 부피의 2-5배로 뉴클레아제가 없는 물로 펠릿을 재현탁시킵니다. -20 °C 또는 -70 °C에서 보관하십시오.
   참고: dsRNA 펠릿은 완전히 재현탁되기 어려울 수 있으므로 과도하게 건조해서는 안 됩니다. 충분한 재중단을 보장하려면 최소 2개의 볼륨이 필요합니다.
7. dsRNA의 수량 및 품질 검사: dsRNA를 뉴클레아제가 없는 물에 1:100에서 1:300의 비율로 희석합니다. 제조업체의 지침에 따라 마이크로볼륨 분광 광도계(Table of Materials)를 사용하여 dsRNA의 농도를 측정합니다. dsRNA를 정량화하려면 농도에 부피를 곱합니다. dsRNA의 품질을 평가하려면 아가로스 겔 전기영동을 사용하십시오. 1x TAE에 1% 아가로스 겔을 준비하고 dsRNA를 뉴클레아제가 없는 물로 1:50에 희석합니다. 레인당 5μL의 희석된 dsRNA를 사용하고 시각화를 위해 0.5mg/mL 에티듐 브로마이드로 겔을 최소 15분 동안 염색합니다.
   참고: dsRNA는 dsDNA보다 더 느리게 이동합니다.

4. 키토산/dsRNA 나노입자의 제조

1. 실온에서 100mM 아세트산나트륨(0.1M NaC_2H3O2및 0.1M 아세트산, 탈이온수의 경우 pH 4.5) 및 100mM 황산나트륨(탈이온수의 경우 100mM Na₂SO₄) 완충액을 만듭니다.
2. 상용화 된 키토산을 용해 (새우 껍질, ≥75 % 탈아세틸화; 재료 목차) 100mM 아세트산 나트륨 완충액에 0.02%(w/v) 키토산 용액을 만듭니다.
3. dsRNA 20μg을 뉴클레아제가 없는 물 50μL에 용해시키고 50μL의 100mM 황산나트륨 완충액에 첨가하여 100μL dsRNA 용액을 만듭니다.
4. 100μL의 dsRNA 용액에 100μL의 키토산 용액을 추가합니다. 동시에 100μL의 키토산 용액을 50mM 황산나트륨 100μL에 추가하여 대조군을 준비합니다. 혼합물을 혼합하고 55°C에서 1분 동안 가열합니다.
5. 나노 입자의 형성을 허용하기 위해 30 초 동안 고속 소용돌이로 혼합물을 즉시 소용돌이 치십시오.
6. 혼합물을 실온에서 13,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 흰색 펠릿을 얻습니다. 상층액을 새 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 펠릿을 실온에서 10분 동안 자연 건조시킵니다.
7. 마이크로볼륨 분광광도계를 사용하여 상층액의 dsRNA 농도를 측정합니다(재료 표). 컨트롤의 상층액을 블랭크로 사용합니다. 농도에 부피를 곱하여 상층액에 남아 있는 dsRNA의 총량을 계산합니다. 나노입자에 캡슐화된 dsRNA의 비율을 상층액에 남아 있는 양을 dsRNA의 시작 양으로 나눈 값으로 계산합니다.
   참고 : 나노 입자는 사용¹⁴ 전에 최소 15 일 동안 4-37 ° C에서 보관 할 수 있지만 가능한 한 빨리 나노 입자를 사용하는 것이 좋습니다.

5. 누에 유충에 키토산/dsRNA 나노입자 먹이기

1. 먹이 실험을 위해 같은 크기의 갓 털갈이한 5^번째 인스타 누에 유충(즉, 5^번째 인스타 1일)을 선택합니다. 덮개를 닫고 24시간 동안 굶기 전에 유충을 6웰 플레이트의 각 웰에 개별적으로 놓습니다.
2. 신선한 뽕나무 잎을 탈 이온수로 헹구고 깨끗한 키친 페이퍼로 말리십시오. 뽕나무 잎은 물방울 없이 건조해야 합니다. 1cm x 1cm 뽕나무 잎 디스크로 자릅니다.
3. 사용하기 전에 키토산/dsRNA 나노입자를 500ng/μL의 뉴클레아제가 없는 물에 용해시킵니다. 대조군 키토산 나노 입자 (4.4에서 제조)를 동일한 부피의 뉴클레아제가없는 물로 희석합니다. nuclease가 없는 물에서 500ng/μL까지 naked dsRNA를 준비합니다.
4. RNAi knockdown 실험에 키토산/dsRNA 나노입자를 사용하고, 대조군 키토산 나노입자를 블랭크/음성 대조군으로 사용합니다. naked dsRNA를 사용하여 키토산/dsRNA 나노입자와의 차이점을 비교합니다.
5. 각 잎 디스크의 표면에 각각 10μL의 키토산/dsRNA 나노입자, 키토산 및 네이키드 dsRNA를 코팅합니다. 잎 디스크의 나노입자 용액과 dsRNA 용액을 실온에서 5분 동안 자연 건조합니다.
6. 각 유충에 하루에 하나의 나노입자 코팅 또는 dsRNA 코팅 잎 디스크를 공급합니다. 나노입자 코팅 또는 dsRNA 코팅된 잎 디스크를 유충에 5일 동안 지속적으로 제공합니다. 신선한 뽕나무 잎은 코팅된 잎 원반을 매일 유충이 완전히 먹은 후에 제공할 수 있습니다.
7. 6일째에는 유충이 움직이지 않을 때까지 얼음 위에서 마취하고 샘플링을 위해 유충을 해부합니다. 깨끗한 페트리 접시에 가위로 흉부를 잘라냅니다. 핀셋으로 중장을 빼냅니다. 중장의 내용물을 제거하고 뉴클레아제가 없는 물로 채워진 다른 페트리 접시에 중장을 씻습니다. 미드굿을 1.5mL 튜브에 넣고 -70°C에서 보관합니다.

6. 유전자 침묵 확인

1. qRT-PCR(quantitative Real-time PCR)을 수행하여 상대 전사체 정량화를 계산합니다. 각 생물학적 복제에 대해 최소 3개의 생물학적 복제와 3개의 기술적 복제가 필요합니다. 상대적 전사체를 정규화하기 위해 최소 두 개의 참조 유전자가 권장됩니다. Bombyx Toll9-2 (BmToll9-2) 유전자를 검사합니다. 상대적 전사체의 평균값을 대조군과 비교하여 유전자 침묵 효율을 평가하고 이를 백분율로 변환합니다.
   참고: qRT-PCR 증폭 조건, 프라이머 정보 및 상대 전사체 계산은 최근 간행물²⁰에서 확인할 수 있습니다.
2. RNAi 표현형을 분석하여 유전자 침묵 효과를 평가합니다. 유충과 고치의 크기를 관찰하십시오. 외모를 기록하기 위해 매일 사진을 찍습니다.
   참고: RNAi는 형태학, 변형, 생리학 및 행동에 영향을 미칠 수 있습니다. RNAi 관련 표현형의 관찰은 표적 유전자에 따라 다릅니다.

결과

RNAi 효율성을 평가하기 위해 BmToll9-2 를 표적으로 하는 면역 유전자를 분석 대상으로 선택했습니다. BmToll9-2 유전자는 실험실에서 잘 규명되어 있으며, dsRNA 주입에 의한 유전자 침묵은 최근 간행물²⁰에서 더 가볍고 작은 유충을 생성합니다. 키토산/dsRNA 나노입자를 통한 섭취에 의한 RNAi 효능을 확인하기 위해 키토산 나노입자를 대조군으로 ?...

토론

표적 유전자에 따라 RNAi 표현형 관찰에는 적절한 단계가 중요합니다. 우리의 예비 결과는 Toll9-2 가 누에의 성장에 관여한다는 것을 보여주었다. 누에 유충의 크기와 무게는 5^인 스타²¹에서 급격히 증가합니다. 따라서, 5^번째 인스타 유충을 키토산/dsRNA 나노입자 섭식 실험의 단계로 선정한다. 또한 섭식 실험을 위해 3^번째 또...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tube	Sangon	F601620	for dsRNA or nanoparticles reaction
10 μl pipette	Eppendorf	P13473G	to aspirate or resuspend liquid
100 μl pipette	Eppendorf	Q12115G	to aspirate or resuspend liquid
2.5 μl pipette	Eppendorf	P20777G	to aspirate or resuspend liquid
20 μl pipette	Eppendorf	H19229E	to aspirate or resuspend liquid
200 μl pipette	Eppendorf	H20588E	to aspirate or resuspend liquid
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Costar	3516	for silkworm rearing individually
Acetic acid	Aladdin	A116165	to make TAE
Agarose M	BBI Life Sciences	A610013	for agarose gel electrophosis
Analytical balance	Sartorius	BSA224S	to weight ingredients
Centrifuge	Sartorius	Centrisart A-14C	to centrifuge to form dsRNA or nanoparticles
Chitosan	Sigma-Aldrich	C3646	to combine with dsRNA for preparation of nanoparticles
EDTA	Sangon	A500895	to make TAE
Ethanol	Aladdin	E130059	to make TAE, or for dsRNA precipitation
Freezer	Siemens	iQ300	to store dsRNA or nanoparticles
GoTaq Green Master Mix	Promega	M712	for PCR reaction
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6002	for qRT-PCR reaction
Isopropanol	Aladdin	I112011	for dsRNA precipitation
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher	One	to determine the concentration of dsRNA
ph meter	Sartorius	PB-10	to prepare buffers
SanPrep Column PCR Product Purification Kit	Sangon	B518141	for PCR product purification
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889	to make 100 mM sodium acetate buffer
Sodium sulfate	Sigma-Aldrich	239313	to make 100 mM sodium sulfate buffer
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	for dsRNA synthesis
ThermoMixer	Eppendorf	C	for dsRNA generation or nanoparticles heating
Tris	Sangon	A501492	to make TAE
Vortex	IKA	Vortex 3	to prepare chitosan/dsRNA nanoparticles