키토산/dsRNA 나노입자 전달을 통한 누에 Bombyx mori 의 유충 RNA 간섭

요약

여기에는 누에 Bombyx mori 유충에서 키토산/dsRNA 나노입자 전달을 통해 유전자 침묵을 유도하기 위한 프로토콜이 제시되어 있습니다.

초록

누에인 Bombyx mori는 중국에서 수천 년의 역사를 가진 중요한 경제적 곤충입니다. 한편, 누에는 기초 연구가 잘 축적된 나비목의 모델 곤충입니다. 또한 완전한 게놈 염기서열 분석 및 조립이 이루어진 나비목의 첫 번째 곤충으로 유전자 기능 연구를 위한 견고한 기반을 제공합니다. RNA 간섭(RNAi)은 역 유전자 기능 연구에 널리 사용되지만 누에 및 기타 나비목 종에서는 불응성입니다. 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 전달하기 위한 이전의 성공적인 RNAi 관련 연구는 주입을 통해서만 수행되었습니다. 수유를 통한 dsRNA의 전달은 보고된 적이 없습니다. 이 기사에서는 누에 유충에 섭취하여 공급되는 키토산/dsRNA 나노입자를 준비하는 단계별 절차를 설명합니다. 이 프로토콜에는 (i) 누에 유충의 적절한 단계 선택, (ii) dsRNA 합성, (iii) 키토산/dsRNA 나노입자 준비, (iv) 누에 유충에 키토산/dsRNA 나노입자 공급이 포함됩니다. 유전자 전사체 확인 및 표현형 관찰을 포함한 대표적인 결과를 제시합니다. dsRNA 섭식은 누에 유충의 RNAi를 위한 간단한 기술입니다. 누에 유충은 기르기 쉽고 활동할 수 있을 만큼 충분히 크기 때문에 곤충에서 유충 RNAi를 입증할 수 있는 좋은 모델을 제공합니다. 또한 이 기술의 단순성은 연구에 대한 더 많은 학생 참여를 자극하여 누에 유충을 교실 환경에서 사용하기에 이상적인 유전 시스템으로 만듭니다.

서문

누에인 Bombyx mori는 5000년 전에 중국에서 길들여진 곤충입니다. 실크를 생산하는 능력으로 인해 누에는 중국 농업 및 양잠에서 중요한 경제적 곤충입니다. 누에는 초파리 다음으로 모델 곤충으로 꼽힌다. 나비목의 모델 곤충인 누에는 키우기 쉽고 몸집이 크고 돌연변이가 많습니다. 한편, 누에는 완전한 게놈 염기서열¹을 가진 최초의 나비목 곤충입니다. 게놈², 전사체³, 발현된 서열 태그(EST)⁴, 비암호화 RNA⁵ 및 현미부수체⁶ 에 대한 정보를 제공하는 많은 데이터베이스도 일반에 공개되어 있습니다. 위의 사실들은 누에를 유전자 연구를 위한 완벽한 모델로 만든다.

RNA 간섭(RNAi)은 이중 가닥 RNA(dsRNA) 분자가 상보적 메신저 RNA(mRNA)와 결합하고 절단하여 표적 유전자의 침묵 효과를 달성하는 세포 과정입니다. 이 메커니즘은 바이러스의 침입을 방어하기 위해 박테리아에 자연적으로 존재한다

프로토콜

1. 누에의 종과 사육

1. B. mori P50 균주의 갓 부화한^1st instar 누에 유충 최소 120 마리를 25 ± 1 °C, 광주기 12 시간 밝은 곳 : 12 시간 어둡고 75 % ± 5 % 상대 습도에서 신선한 뽕나무 잎을 가지고 있습니다.

2. 누에 유충의 선택

1. RNAi 실험을 위해 5^번째 instar 유충의 1일을 선택합니다. 누에 유충은 5^일 째 인스타의 3일째 이후에 빠르게 자라며, 이는 유충 모양의 차이를 비교하는 데 이상적입니다.
   참고: 또는 3^번째 또는 4^번째 instar와 같은 더 젊은 단계를 RNAi 실험에 사용할 수 있습니다. 그러나 5^번째 instar까지 지속적인 dsRNA 처리가 필요하기 때문에 상대적으로 비용이 많이 들고 재료비도 많이 듭니다.

3. dsRNA의 합성

1. dsRNA target fragme....

토론

표적 유전자에 따라 RNAi 표현형 관찰에는 적절한 단계가 중요합니다. 우리의 예비 결과는 Toll9-2 가 누에의 성장에 관여한다는 것을 보여주었다. 누에 유충의 크기와 무게는 5^인 스타²¹에서 급격히 증가합니다. 따라서, 5^번째 인스타 유충을 키토산/dsRNA 나노입자 섭식 실험의 단계로 선정한다. 또한 섭식 실험을 위해 3^번째 또.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tube	Sangon	F601620	for dsRNA or nanoparticles reaction
10 μl pipette	Eppendorf	P13473G	to aspirate or resuspend liquid
100 μl pipette	Eppendorf	Q12115G	to aspirate or resuspend liquid
2.5 μl pipette	Eppendorf	P20777G	to aspirate or resuspend liquid
20 μl pipette	Eppendorf	H19229E	to aspirate or resuspend liquid
200 μl pipette	Eppendorf	H20588E	to aspirate or resuspend liquid
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Costar	3516	for silkworm rearing individually
Acetic acid	Aladdin	A116165	to make TAE
Agarose M	BBI Life Sciences	A610013	for agarose gel electrophosis
Analytical balance	Sartorius	BSA224S	to weight ingredients
Centrifuge	Sartorius	Centrisart A-14C	to centrifuge to form dsRNA or nanoparticles
Chitosan	Sigma-Aldrich	C3646	to combine with dsRNA for preparation of nanoparticles
EDTA	Sangon	A500895	to make TAE
Ethanol	Aladdin	E130059	to make TAE, or for dsRNA precipitation
Freezer	Siemens	iQ300	to store dsRNA or nanoparticles
GoTaq Green Master Mix	Promega	M712	for PCR reaction
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6002	for qRT-PCR reaction
Isopropanol	Aladdin	I112011	for dsRNA precipitation
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher	One	to determine the concentration of dsRNA
ph meter	Sartorius	PB-10	to prepare buffers
SanPrep Column PCR Product Purification Kit	Sangon	B518141	for PCR product purification
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889	to make 100 mM sodium acetate buffer
Sodium sulfate	Sigma-Aldrich	239313	to make 100 mM sodium sulfate buffer
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	for dsRNA synthesis
ThermoMixer	Eppendorf	C	for dsRNA generation or nanoparticles heating
Tris	Sangon	A501492	to make TAE
Vortex	IKA	Vortex 3	to prepare chitosan/dsRNA nanoparticles