幼虫 RNA 通过壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒递送对 家蚕 Bombyx 的 干扰

摘要

这里介绍的是家蚕 Bombyx mori 幼虫中壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒递送的方案，以通过摄入诱导基因沉默。

摘要

家蚕 Bombyx mori 是一种重要的经济昆虫，在中国已有数千年的历史。同时，蚕是鳞翅目昆虫的模式昆虫，具有较好的基础研究积累。它也是鳞翅目中第一个完成完整基因组测序和组装的昆虫，为基因功能研究提供了坚实的基础。尽管 RNA 干扰 （RNAi） 广泛用于反向基因功能研究，但它在家蚕和其他鳞翅目物种中是难治性的。先前成功的 RNAi 相关研究以递送双链 RNA （dsRNA） 仅通过注射进行。从未报道过通过饲喂递送 dsRNA。在本文中，我们描述了制备壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒的分步程序，这些颗粒通过摄入喂给家蚕幼虫。该方案包括 （i） 选择蚕幼虫的适当阶段，（ii） dsRNA 的合成，（iii） 壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒的制备，以及 （iv） 用壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒喂养蚕幼虫。介绍了代表性结果，包括基因转录本确认和表型观察。dsRNA 喂养是一种用于家蚕幼虫 RNAi 的简单技术。由于家蚕幼虫易于饲养且足够大，因此它为证明昆虫中的幼虫 RNAi 提供了一个很好的模型。此外，这种技术的简单性激发了更多的学生参与研究，使蚕幼虫成为在课堂环境中使用的理想遗传系统。

引言

家蚕 Bombyx mori 是一种 5000 多年前在中国驯化的昆虫。由于蚕能够生产蚕丝，蚕是中国农业和养蚕业中的重要经济昆虫。蚕是仅次于果蝇的模式昆虫。作为鳞翅目中的模式昆虫，蚕易于饲养，体型大，突变体多。同时，蚕是第一个完整基因组测序的鳞翅目昆虫¹.许多数据库也向公众提供基因组²、转录组³、表达序列标签 （EST）⁴、非编码 RNA⁵ 和微卫星⁶ 的信息。以上事实使蚕成为基因研究的完美模型。

RNA 干扰 （RNAi） 是一种细胞过程，其中双链 RNA （dsRNA） 分子结合并切片互补信使 RNA （mRNA），从而达到靶基因的沉默效果。这种机制天然存在于细菌中，以抵御病毒的入侵⁷。后来，发现 RNAi 在动物、植物和微生物中是保守的。由于其强大的序列特异性沉默作用，RNAi 在基础研究中用于操纵基因表达和研究基因功能。RNAi 是通过将 dsRNA 递送到细胞中来实现的。

在昆虫中，有三种常见的 dsRNA 递送方式，分别是显微注射、喂食和浸泡⁸。目前，通过 dsRNA 注射通过裸 dsRNA 递送在家蚕中成功报告^{RNAi 9}。显微注射的优点是 dsRNA 立即输送到血淋巴中，并精确控制 dsRNA 量。然而，显微注射也存在某些缺点。例如，它很耗时，并且需要精密的设备。优化注射针、注射体积和 dsRNA 量也很重要。因此，需要一种将 dsRNA 递送给家蚕的替代方法。因为昆虫的外骨骼是由几丁质制成的水密屏障，所以浸泡昆虫幼虫以获得 RNAi 的报道很少，这对于昆虫中的 RNAi 来说不是一个好的选择。dsRNA 的补料省力、成本效益高且易于执行¹⁰.该方法也适用于高通量基因筛选¹¹。然而，发现一种 DNA/RNA 非特异性核酸酶，即 BmdsRNase，存在于家蚕幼虫的中肠和中肠液^{中 12}。该核酸酶可消化 dsRNA，最好是¹³。因此，将裸露的 dsRNA 喂给家蚕以沉默基因表达似乎很困难。

最近，纳米颗粒屏蔽的 dsRNA 被证明是通过饲养¹⁴ 来提高 RNAi 效率的良好替代方案。壳聚糖是一种廉价、无毒且可生物降解的聚合物，可以通过甲壳素的脱乙酰化制备，甲壳素是一种天然存在的，是仅次于纤维素¹⁵ 的第二丰富的生物聚合物。由于壳聚糖中的氨基带正电，而 dsRNA 骨架上的磷酸基带负电，因此可以通过聚阳离子的自组装形成壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒¹⁶。壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒通过蚊子埃及伊 蚊 和冈 比亚按蚊¹⁷、棉斑棉铃虫 Earias vittella¹⁸ 和胭脂红蜘蛛螨 Tetranychus cinnabarinus¹⁹ 的幼虫摄食可有效获得 RNAi。

为了开发一种通过喂养家蚕来获得成功的 RNAi 效率的 dsRNA 递送方法，本报告侧重于描述如何制备壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒并将纳米颗粒喂给家蚕幼虫的分步程序。这种方法相对便宜、省力且易于遵循，可以适用于其他昆虫的基因沉默研究。我们的目标是为鳞翅目 dsRNA 递送方法提供一种更简单的方案，具有更高的 RNAi 效率。

研究方案

1. 蚕种和饲养

1. 在 25 ± 1 °C，光周期 12 小时光照：12 小时黑暗和 75% ± 5% 相对湿度下，饲养至少 120 只新鲜孵化的 1 龄家蚕幼虫和新鲜桑叶。

2. 蚕幼虫的选择

1. 挑选^{第 5 龄} 幼虫的第 1 天进行 RNAi 实验;蚕幼虫在^第 3 龄后生长迅速，这是比较幼虫外观差异的理想选择。
   注：或者，较年轻的阶段，例如^第 3^{或第 4 龄} ，可用于 RNAi 实验。然而，它需要持续的 dsRNA 处理直到^{第 5 龄} ，这相对昂贵且材料成本高昂。

3. dsRNA 的合成

1. 鉴定 dsRNA 靶片段：选择靶基因的编码序列，并将其与其他同源基因比对，以确定保守区域。在非保守区域设计基因特异性引物，用于后续的 dsRNA 靶片段扩增。对于昆虫的 RNAi 实验，典型的 dsRNA 靶片段通常为 400-600 bp。最小大小可以是 200 bp。
   注：为了提高 RNAi 实验的效率和成功率，可以使用一些基于 Web 的工具来设计 dsRNA 靶标，例如 dsRNA Engineer （https://dsrna-engineer.cn/）。
2. 制备 PCR 产物模板：将 T7 RNA 聚合酶启动子 （5'-TAATACGACTCACTATAGG-3'） 添加到上述任一引物的 5'-末端。进行标准 PCR 以扩增 dsRNA 靶片段。在 1x TAE 中运行 1% 琼脂糖凝胶，以验证预期大小的单个 PCR 产物。之后，用纯化试剂盒（材料表）纯化 PCR 产物并将其用于后续转录。
   注：为了长期储存目标 PCR 产物并获得高产量，建议将 PCR 产物连接到质粒上。质粒应在 PCR 反应前线性化。
3. dsRNA 的生成：使用 T7 RNAi 系统（材料表）生成 dsRNA。根据制造商的说明，在室温下添加组分来设置反应。轻轻移液混合反应物，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。
   注意：为了最大限度地提高产量，在 37 °C 下的孵育可以延长至 2-6 小时。对于包含二级结构或富含 GC 的模板，可以在 42 °C 下进行孵育，以提高 dsRNA 的产量。
4. 退火形成 dsRNA：将反应物在 70 °C 下孵育 10 分钟，然后缓慢冷却至室温（~20 分钟）。这将使 dsRNA 退火。
5. DNase 和 RNase 处理：将 1 μL 提供的 RNase 溶液移液到 199 μL 无核酸酶的水中，制成新鲜稀释的 RNase 溶液。每 20 μL 反应体积加入 1 μL 新鲜稀释的 RNase 溶液和 1 μL 提供的不含 RQ1 RNase 的 DNase，轻轻混合，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。处理后，反应中的单链 RNA （ssRNA） 和模板 DNA 将被去除。
6. 醇沉淀：向反应中加入 1 体积的异丙醇或 2.5 体积的 95% 乙醇以及 0.1 体积的 3 M 乙酸钠 （pH 5.2）。涡旋混合反应物，并在冰上孵育 5 分钟，形成浑浊团块。在离心机中以最大速度旋转 10 分钟，以在试管底部收集白色颗粒。弃去上清液，用 0.5 mL 冷的 70% 乙醇洗涤沉淀，以去除残留的盐。洗涤后去除乙醇。让沉淀在室温下风干 15 分钟。用不含核酸酶的水以初始反应体积的 2-5 倍重悬沉淀。储存在 -20 °C 或 -70 °C。
   注：dsRNA 沉淀不应过度干燥，因为这会使其难以完全重悬。为确保充分重悬，至少需要 2 个体积。
7. dsRNA 的数量和质量检查：用无核酸酶的水以 1：100 至 1：300 的比例稀释 dsRNA。根据制造商的说明，使用微量分光光度计（材料表）测定 dsRNA 的浓度。要定量 dsRNA，请将浓度乘以体积。要评估 dsRNA 的质量，请使用琼脂糖凝胶电泳。在 1x TAE 中制备 1% 琼脂糖凝胶，并用无核酸酶水以 1：50 稀释 dsRNA。每个泳道使用 5 μL 稀释的 dsRNA，并在 0.5 mg/mL 溴化乙锭中对凝胶染色至少 15 分钟以进行可视化。
   注意：dsRNA 的迁移速度比 dsDNA 慢。

4. 壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒的制备

1. 在室温下制备 100 mM 乙酸钠（0.1 M NaC₂H₃O₂ 和 0.1 M 乙酸，pH 4.5 在去离子水中）和 100 mM 硫酸钠（100 mM Na₂SO₄ 在去离子水中）缓冲液。
2. 溶解市售壳聚糖（来自虾壳，≥75% 脱乙酰; 材料表）在 100 mM 乙酸钠缓冲液中制备 0.02% （w/v） 壳聚糖溶液。
3. 将 20 μg dsRNA 溶解在 50 μL 无核酸酶水中，并将其添加到 50 μL 100 mM 硫酸钠缓冲液中，制成 100 μL dsRNA 溶液。
4. 将 100 μL 壳聚糖溶液添加到 100 μL dsRNA 溶液中。同时，通过将 100 μL 壳聚糖溶液添加到 100 μL 50 mM 硫酸钠中来制备对照。混合混合物并在 55 °C 下加热 1 分钟。
5. 立即用高速涡旋将混合物涡旋 30 秒，以形成纳米颗粒。
6. 在室温下以 13,000 x g 离心混合物 10 分钟，以获得白色沉淀。将上清液转移至新的 1.5 mL 试管中。让沉淀在室温下风干 10 分钟。
7. 使用微量分光光度计测定上清液中 dsRNA 的浓度（材料表）。使用对照中的上清液作为空白。将浓度乘以体积以计算上清液中剩余的 dsRNA 总量。通过上清液中剩余的量除以 dsRNA 的起始量来计算纳米颗粒中封装的 dsRNA 的百分比。
   注意：尽管纳米颗粒可以在使用 4 之前在 37-14 °C 下保存至少¹⁵ 天，但建议尽快使用纳米颗粒。

5. 用壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒喂养家蚕幼虫

1. 挑选相同大小的新鲜蜕皮的 5^龄蚕幼虫（即 5 龄的第 1 天）进行摄食实验。将幼虫单独放入 6 孔板的每个孔中，然后关闭盖子并饥饿 24 小时。
2. 用去离子水冲洗新鲜的桑叶，然后用干净的厨房纸擦干。桑叶应该是干燥的，没有水滴。切成 1 厘米 x 1 厘米的桑叶片。
3. 使用前，将壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒以 500 ng/μL 的浓度溶解在无核酸酶的水中。用相同体积的无核酸酶水稀释对照壳聚糖纳米颗粒（以 4.4 制备）。在无核酸酶的水中制备 500 ng/μL 的裸 dsRNA。
4. 使用壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒进行 RNAi 敲低实验，对照壳聚糖纳米颗粒作为空白/阴性对照。使用裸露的 dsRNA 比较与壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒的差异。
5. 在每个叶盘的表面分别涂覆 10 μL 壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒、壳聚糖和裸露的 dsRNA。在室温下将叶盘上的纳米颗粒溶液和 dsRNA 溶液风干 5 分钟。
6. 每天用一个纳米颗粒包被或 dsRNA 包被的叶盘喂养每个幼虫。向幼虫连续提供纳米颗粒包被或 dsRNA 包被的叶盘 5 天。每天被幼虫完全吃掉涂层叶盘后，可以提供新鲜的桑叶。
7. 第 6 天，在冰上麻醉幼虫，直到它们不移动并解剖幼虫进行采样。在干净的培养皿上用剪刀剪掉胸部。用镊子拉出中肠。去除中肠中的内容物，并在另一个装满无核酸酶水的培养皿中清洗中肠。将中肠储存在 1.5 mL 管中并保持在 -70 °C。

6. 确认基因沉默

1. 进行定量实时 PCR （qRT-PCR） 以计算相对转录本定量。每个生物重复至少需要 3 个生物学重复和 3 个技术重复。建议使用至少两个参考基因来标准化相对转录本。检测 Bombyx Toll9-2 （BmToll9-2） 基因。通过将相对转录本的平均值与对照组进行比较来评估基因沉默效率，并将其转换为百分比。
   注：qRT-PCR 扩增条件、引物信息和相对转录本计算可在我们最近的出版物²⁰ 中找到。
2. 分析 RNAi 表型以评估基因沉默效果。观察幼虫和茧的大小。每天拍照以记录外观。
   注：RNAi 可影响形态、、生理学和行为。RNAi 相关表型的观察取决于靶向基因。

结果

为了评估 RNAi 效率，选择靶向 BmToll9-2 的免疫基因进行分析。 BmToll9-2 基因在实验室中得到了很好的表征，在我们最近的出版物²⁰ 中，通过 dsRNA 注射进行基因沉默导致幼虫更轻、更小。为了通过壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒摄入来确认 RNAi 功效，以壳聚糖纳米颗粒作为对照，同时比较裸露的 dsRNA。

与对照相比，不含 dsRNA 的壳聚...

讨论

适当的阶段对于 RNAi 表型观察很重要，具体取决于靶向基因。我们的初步结果表明，Toll9-2 参与蚕的生长。蚕幼虫的大小和重量在^第 5 龄迅速增加²¹.因此，选择第 5^龄幼虫作为壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒取食实验的阶段。也可以选择第 3^龄或第 4 龄幼虫进行摄食实验，并观察^第 5 龄幼虫的发育差异。然而，纳米颗?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tube	Sangon	F601620	for dsRNA or nanoparticles reaction
10 μl pipette	Eppendorf	P13473G	to aspirate or resuspend liquid
100 μl pipette	Eppendorf	Q12115G	to aspirate or resuspend liquid
2.5 μl pipette	Eppendorf	P20777G	to aspirate or resuspend liquid
20 μl pipette	Eppendorf	H19229E	to aspirate or resuspend liquid
200 μl pipette	Eppendorf	H20588E	to aspirate or resuspend liquid
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Costar	3516	for silkworm rearing individually
Acetic acid	Aladdin	A116165	to make TAE
Agarose M	BBI Life Sciences	A610013	for agarose gel electrophosis
Analytical balance	Sartorius	BSA224S	to weight ingredients
Centrifuge	Sartorius	Centrisart A-14C	to centrifuge to form dsRNA or nanoparticles
Chitosan	Sigma-Aldrich	C3646	to combine with dsRNA for preparation of nanoparticles
EDTA	Sangon	A500895	to make TAE
Ethanol	Aladdin	E130059	to make TAE, or for dsRNA precipitation
Freezer	Siemens	iQ300	to store dsRNA or nanoparticles
GoTaq Green Master Mix	Promega	M712	for PCR reaction
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6002	for qRT-PCR reaction
Isopropanol	Aladdin	I112011	for dsRNA precipitation
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher	One	to determine the concentration of dsRNA
ph meter	Sartorius	PB-10	to prepare buffers
SanPrep Column PCR Product Purification Kit	Sangon	B518141	for PCR product purification
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889	to make 100 mM sodium acetate buffer
Sodium sulfate	Sigma-Aldrich	239313	to make 100 mM sodium sulfate buffer
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	for dsRNA synthesis
ThermoMixer	Eppendorf	C	for dsRNA generation or nanoparticles heating
Tris	Sangon	A501492	to make TAE
Vortex	IKA	Vortex 3	to prepare chitosan/dsRNA nanoparticles