幼虫 RNA 通过壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒递送对 家蚕 Bombyx 的 干扰

摘要

这里介绍的是家蚕 Bombyx mori 幼虫中壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒递送的方案，以通过摄入诱导基因沉默。

摘要

家蚕 Bombyx mori 是一种重要的经济昆虫，在中国已有数千年的历史。同时，蚕是鳞翅目昆虫的模式昆虫，具有较好的基础研究积累。它也是鳞翅目中第一个完成完整基因组测序和组装的昆虫，为基因功能研究提供了坚实的基础。尽管 RNA 干扰 （RNAi） 广泛用于反向基因功能研究，但它在家蚕和其他鳞翅目物种中是难治性的。先前成功的 RNAi 相关研究以递送双链 RNA （dsRNA） 仅通过注射进行。从未报道过通过饲喂递送 dsRNA。在本文中，我们描述了制备壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒的分步程序，这些颗粒通过摄入喂给家蚕幼虫。该方案包括 （i） 选择蚕幼虫的适当阶段，（ii） dsRNA 的合成，（iii） 壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒的制备，以及 （iv） 用壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒喂养蚕幼虫。介绍了代表性结果，包括基因转录本确认和表型观察。dsRNA 喂养是一种用于家蚕幼虫 RNAi 的简单技术。由于家蚕幼虫易于饲养且足够大，因此它为证明昆虫中的幼虫 RNAi 提供了一个很好的模型。此外，这种技术的简单性激发了更多的学生参与研究，使蚕幼虫成为在课堂环境中使用的理想遗传系统。

引言

家蚕 Bombyx mori 是一种 5000 多年前在中国驯化的昆虫。由于蚕能够生产蚕丝，蚕是中国农业和养蚕业中的重要经济昆虫。蚕是仅次于果蝇的模式昆虫。作为鳞翅目中的模式昆虫，蚕易于饲养，体型大，突变体多。同时，蚕是第一个完整基因组测序的鳞翅目昆虫¹.许多数据库也向公众提供基因组²、转录组³、表达序列标签 （EST）⁴、非编码 RNA⁵ 和微卫星⁶ 的信息。以上事实使蚕成为基因研究的完美模型。

RNA 干扰 （RNAi） 是一种细胞过程，其中双链 RNA （dsRNA） 分子结合并切片互补信使 RNA （mRNA），从而达到靶基因的沉默效果。这种机制天然存在于细菌中，以抵御病毒的入侵⁷。后来，发现 RNAi 在动物、植物和微生物中是保守的。由于其强大的序列特异性沉默作用，RNAi 在基础研究中用于操纵基因表达和研究基因功能。RNAi 是通过将 dsRNA 递送到细胞中来实现的。

在昆虫中，有三种常见的 ....

研究方案

1. 蚕种和饲养

1. 在 25 ± 1 °C，光周期 12 小时光照：12 小时黑暗和 75% ± 5% 相对湿度下，饲养至少 120 只新鲜孵化的 1 龄家蚕幼虫和新鲜桑叶。

2. 蚕幼虫的选择

1. 挑选^{第 5 龄} 幼虫的第 1 天进行 RNAi 实验;蚕幼虫在^第 3 龄后生长迅速，这是比较幼虫外观差异的理想选择。
   注：或者，较年轻的阶段，例如^第 3^{或第 4 龄} ，可用于 RNAi 实验。然而，它需要持续的 dsRNA 处理直到^{第 5 龄} ，这相对昂贵且材料成本高昂。

3. dsRNA 的合成

1. 鉴定 dsRNA 靶片段：选择靶基因的编码序列，并将其与其他同源基因比对，以确定保守区域。在非保守区域设计基因特异性引物，用于后续的 dsRNA 靶片段扩增。对于昆虫的 RNAi 实验，典型的 dsRNA 靶片段通常为 400-600 bp。最小大小可以是 200 bp。
   注：为了提高 RNAi 实验的效率和成功率，可以使用一些....

结果

为了评估 RNAi 效率，选择靶向 BmToll9-2 的免疫基因进行分析。 BmToll9-2 基因在实验室中得到了很好的表征，在我们最近的出版物²⁰ 中，通过 dsRNA 注射进行基因沉默导致幼虫更轻、更小。为了通过壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒摄入来确认 RNAi 功效，以壳聚糖纳米颗粒作为对照，同时比较裸露的 dsRNA。

与对照相比，不含 dsRNA 的壳聚.......

讨论

适当的阶段对于 RNAi 表型观察很重要，具体取决于靶向基因。我们的初步结果表明，Toll9-2 参与蚕的生长。蚕幼虫的大小和重量在^第 5 龄迅速增加²¹.因此，选择第 5^龄幼虫作为壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒取食实验的阶段。也可以选择第 3^龄或第 4 龄幼虫进行摄食实验，并观察^第 5 龄幼虫的发育差异。然而，纳米颗?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tube	Sangon	F601620	for dsRNA or nanoparticles reaction
10 μl pipette	Eppendorf	P13473G	to aspirate or resuspend liquid
100 μl pipette	Eppendorf	Q12115G	to aspirate or resuspend liquid
2.5 μl pipette	Eppendorf	P20777G	to aspirate or resuspend liquid
20 μl pipette	Eppendorf	H19229E	to aspirate or resuspend liquid
200 μl pipette	Eppendorf	H20588E	to aspirate or resuspend liquid
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Costar	3516	for silkworm rearing individually
Acetic acid	Aladdin	A116165	to make TAE
Agarose M	BBI Life Sciences	A610013	for agarose gel electrophosis
Analytical balance	Sartorius	BSA224S	to weight ingredients
Centrifuge	Sartorius	Centrisart A-14C	to centrifuge to form dsRNA or nanoparticles
Chitosan	Sigma-Aldrich	C3646	to combine with dsRNA for preparation of nanoparticles
EDTA	Sangon	A500895	to make TAE
Ethanol	Aladdin	E130059	to make TAE, or for dsRNA precipitation
Freezer	Siemens	iQ300	to store dsRNA or nanoparticles
GoTaq Green Master Mix	Promega	M712	for PCR reaction
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6002	for qRT-PCR reaction
Isopropanol	Aladdin	I112011	for dsRNA precipitation
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher	One	to determine the concentration of dsRNA
ph meter	Sartorius	PB-10	to prepare buffers
SanPrep Column PCR Product Purification Kit	Sangon	B518141	for PCR product purification
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889	to make 100 mM sodium acetate buffer
Sodium sulfate	Sigma-Aldrich	239313	to make 100 mM sodium sulfate buffer
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	for dsRNA synthesis
ThermoMixer	Eppendorf	C	for dsRNA generation or nanoparticles heating
Tris	Sangon	A501492	to make TAE
Vortex	IKA	Vortex 3	to prepare chitosan/dsRNA nanoparticles