Interferenza dell'RNA larvale nel baco da seta Bombyx mori attraverso la somministrazione di nanoparticelle di chitosano/dsRNA

Riepilogo

Qui viene presentato un protocollo per la somministrazione di nanoparticelle di chitosano/dsRNA nelle larve di Bombyx mori del baco da seta per indurre il silenziamento genico attraverso l'ingestione.

Abstract

Il baco da seta, Bombyx mori, è un importante insetto economico con migliaia di anni di storia in Cina. Nel frattempo, il baco da seta è l'insetto modello dei lepidotteri con un buon accumulo di ricerche di base. È anche il primo insetto nei lepidotteri con il suo genoma completo sequenziato e assemblato, che fornisce una solida base per lo studio della funzionalità genica. Sebbene l'interferenza dell'RNA (RNAi) sia ampiamente utilizzata nello studio funzionale dei geni inversi, è refrattaria nei bachi da seta e in altre specie di lepidotteri. Precedenti ricerche di successo relative all'RNAi per fornire RNA a doppio filamento (dsRNA) sono state eseguite solo attraverso l'iniezione. La somministrazione di dsRNA attraverso l'alimentazione non viene mai riportata. In questo articolo, descriviamo le procedure passo dopo passo per preparare le nanoparticelle di chitosano/dsRNA, che vengono somministrate alle larve del baco da seta mediante ingestione. Il protocollo include (i) la selezione dello stadio corretto delle larve del baco da seta, (ii) la sintesi del dsRNA, (iii) la preparazione delle nanoparticelle di chitosano/dsRNA e (iv) l'alimentazione delle larve del baco da seta con nanoparticelle di chitosano/dsRNA. Vengono presentati risultati rappresentativi, tra cui la conferma del trascritto genico e l'osservazione del fenotipo. L'alimentazione del dsRNA è una tecnica semplice per l'RNAi nelle larve del baco da seta. Poiché le larve del baco da seta sono facili da allevare e abbastanza grandi da poter essere utilizzate, fornisce un buon modello per dimostrare l'RNAi larvale negli insetti. Inoltre, la semplicità di questa tecnica stimola un maggiore coinvolgimento degli studenti nella ricerca, rendendo le larve del baco da seta un sistema genetico ideale per l'uso in classe.

Introduzione

Il baco da seta, Bombyx mori, è un insetto addomesticato più di 5000 anni fa in Cina. Grazie alla sua capacità di produrre seta, il baco da seta è un importante insetto economico nell'agricoltura e nella sericoltura cinesi. Il baco da seta è secondo solo al moscerino della frutta come insetto modello. Come insetto modello nei lepidotteri, il baco da seta è facile da allevare, con un corpo di grandi dimensioni e molti mutanti. Nel frattempo, il baco da seta è il primo insetto lepidottero con il suo genoma completo sequenziato¹. Sono inoltre disponibili al pubblico molti database che forniscono informazioni per il genoma², il trascrittoma³, il tag di sequenza espresso (EST)⁴, l'RNA⁵ non codificante e il microsatellite⁶ . I fatti di cui sopra rendono il baco da seta un modello perfetto per la ricerca genetica.

L'interferenza dell'RNA (RNAi) è un processo cellulare in cui le molecole di RNA a doppio filamento (dsRNA) si legano e tagliano l'RNA messaggero complementare (mRNA), ottenendo così l'effetto di silenziamento del gene bersaglio. Questo meccanismo è naturalmente presente nei batteri per difendersi dall'invasione dei virus⁷. Successivamente, si è scoperto che l'RNAi è conservato negli animali, nelle piante e nei microbi. Grazie al suo potente effetto di silenziamento sequenza-specifico, l'RNAi viene utilizzato nella ricerca fondamentale per manipolare l'espressione genica e studiare la funzione genica. L'RNAi si ottiene attraverso la consegna di dsRNA nelle cellule.

Negli insetti, ci sono tre modi comuni per fornire il dsRNA, che sono la microiniezione, l'alimentazione e l'ammollo⁸. Al momento, i rapporti di RNAi di successo nei bachi da seta attraverso la somministrazione di dsRNA nudi sono condotti mediante iniezione di dsRNA⁹. I vantaggi della microiniezione sono la somministrazione immediata di dsRNA nell'emolinfa e il controllo preciso della quantità di dsRNA. Tuttavia, esistono anche alcuni svantaggi della microiniezione. Ad esempio, richiede molto tempo e dispositivi delicati. È anche importante ottimizzare gli aghi per iniezione, il volume di iniezione e la quantità di dsRNA. Pertanto, diventa necessario un modo alternativo per veicolare il dsRNA ai bachi da seta. Poiché l'esoscheletro di un insetto è una barriera a tenuta stagna fatta di chitina, l'ammollo delle larve di insetti per ottenere l'RNAi è raramente segnalato, il che non è una buona opzione per l'RNAi negli insetti. L'alimentazione del dsRNA è a risparmio di manodopera, economica e facile da eseguire¹⁰. Questo metodo è applicabile anche per lo screening genico ad alto rendimento¹¹. Tuttavia, si è scoperto che una nucleasi non specifica per DNA/RNA, vale a dire la BmdsRNasi, è presente nell'intestino medio e nel succo dell'intestino medio delle larve del baco da seta¹². Questa nucleasi ha dimostrato di digerire il dsRNA, preferibilmente¹³. Pertanto, somministrare dsRNA nudo al baco da seta per silenziare l'espressione genica sembra essere difficile.

Recentemente, il dsRNA schermato con nanoparticelle si è dimostrato una buona alternativa per aumentare l'efficienza dell'RNAi alimentando¹⁴. Il chitosano è un polimero economico, non tossico e biodegradabile, che può essere preparato mediante deacetilazione della chitina, un biopolimero presente in natura e il secondo più abbondante dopo la cellulosa¹⁵. Poiché il gruppo amminico nel chitosano è caricato positivamente e il gruppo fosfato sulla spina dorsale del dsRNA è caricato negativamente, le nanoparticelle di chitosano/dsRNA potrebbero essere formate dall'autoassemblaggio di policationi¹⁶. Le nanoparticelle di chitosano/dsRNA sono efficaci nel raggiungere l'RNAi attraverso l'alimentazione larvale nelle zanzare Aedes aegypti e Anopheles gambiae¹⁷, nel verme macchiato di cotone Earias vittella¹⁸ e nel ragnetto carminio Tetranychus cinnabarinus¹⁹.

Al fine di sviluppare una metodologia per la somministrazione di dsRNA mediante l'alimentazione dei bachi da seta per ottenere un'efficienza RNAi di successo, questo rapporto si concentra sulla descrizione delle procedure passo-passo su come preparare le nanoparticelle di chitosano/dsRNA e alimentare le nanoparticelle alle larve del baco da seta. Questa metodologia è relativamente economica, fa risparmiare manodopera ed è facile da seguire, e può essere adattata per studi di silenziamento genico in altri insetti. Il nostro obiettivo è quello di fornire un protocollo più semplice per il metodo di somministrazione del dsRNA dei lepidotteri con una maggiore efficienza dell'RNAi.

Protocollo

1. Specie di bachi da seta e allevamento

1. Allevare almeno 120 larve di baco da seta appena nate di 1^° stadio del ceppo P50 di B. mori con foglie di gelso fresche a 25 ± 1 °C, fotoperiodo 12 h Luce: 12 h Buio e 75% ± 5% di umidità relativa.

2. Selezione delle larve di baco da seta

1. Scegli il giorno 1 delle larve del 5^° stadio per l'esperimento RNAi; Le larve del baco da seta crescono velocemente dopo il giorno 3 del 5^{° stadio} , il che è l'ideale per confrontare le differenze nell'aspetto larvale.
   NOTA: In alternativa, gli stadi più giovani, come il 3^{° o il} 4^{° stadio} , potrebbero essere utilizzati per l'esperimento RNAi. Tuttavia, richiede un trattamento costante con dsRNA fino al 5^{° stadio} , che è relativamente costoso e costoso in termini di materiale.

3. Sintesi del dsRNA

1. Identificazione del frammento bersaglio del dsRNA: selezionare la sequenza codificante di un gene bersaglio e allinearla con altri geni omologhi per determinare la regione conservata. Progettare primer gene-specifici nella regione non conservata per la successiva amplificazione del frammento bersaglio del dsRNA. Per gli esperimenti di RNAi negli insetti, il tipico frammento bersaglio del dsRNA è generalmente di 400-600 bp. La dimensione minima potrebbe essere di 200 bp.
   NOTA: Per migliorare l'efficienza e il tasso di successo degli esperimenti RNAi, è possibile utilizzare alcuni strumenti basati sul web per progettare il bersaglio del dsRNA, come il dsRNA Engineer (https://dsrna-engineer.cn/).
2. Produzione del modello di prodotto PCR: aggiungere un promotore della RNA polimerasi T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3') all'estremità 5' di uno dei primer progettati sopra. Eseguire la PCR standard per amplificare il frammento bersaglio del dsRNA. Eseguire un gel di agarosio all'1% in 1x TAE per verificare un singolo prodotto PCR della dimensione prevista. Successivamente, purificare il prodotto PCR con un kit di purificazione (Tabella dei materiali) e utilizzarlo per la successiva trascrizione.
   NOTA: Per conservare il prodotto PCR target a lungo termine e ottenere rese elevate, si consiglia di legare il prodotto PCR a un plasmide. Il plasmide deve essere linearizzato prima della reazione di PCR.
3. Generazione di dsRNA: utilizzare un sistema RNAi T7 (Table of Materials) per generare il dsRNA. Impostare la reazione aggiungendo i componenti a temperatura ambiente secondo le istruzioni del produttore. Miscelare la reazione pipettando delicatamente e incubare a 37 °C per 30 minuti.
   NOTA: Per massimizzare la resa, l'incubazione a 37 °C può essere prolungata fino a 2-6 ore. Per i modelli contenenti una struttura secondaria o ricca di GC, l'incubazione può essere eseguita a 42 °C per migliorare la resa del dsRNA.
4. Ricottura per formare dsRNA: Incubare la reazione a 70 °C per 10 minuti, quindi raffreddare lentamente a temperatura ambiente (~20 minuti). Questo ridurrà il dsRNA.
5. Trattamento con DNasi e RNasi: Pipettare 1 μL della soluzione di RNasi fornita in 199 μL di acqua priva di nucleasi per ottenere una soluzione di RNasi appena diluita. Aggiungere 1 μL di soluzione di RNasi appena diluita e 1 μL di DNasi priva di RNasi RQ1 fornita per 20 μL di volume di reazione, mescolare delicatamente e incubare a 37 °C per 30 minuti. L'RNA a filamento singolo (ssRNA) e il DNA stampo nella reazione verranno rimossi dopo questo trattamento.
6. Precipitazione alcolica: aggiungere alla reazione 1 volume di isopropanolo o 2,5 volumi di etanolo al 95% insieme a 0,1 volumi di acetato di sodio 3 M (pH 5,2). Mescolare la reazione per vortice e incubare su ghiaccio per 5 minuti per formare una massa torbida. Centrifugare alla massima velocità in una centrifuga per 10 minuti per raccogliere un pellet bianco sul fondo del tubo. Scartare il surnatante e lavare il pellet con 0,5 ml di etanolo freddo al 70% per rimuovere il sale residuo. Rimuovere l'etanolo dopo il lavaggio. Lasciare asciugare il pellet all'aria a temperatura ambiente per 15 minuti. Risospendere il pellet con acqua priva di nucleasi in 2-5 volte il volume di reazione iniziale. Conservare a -20 °C o -70 °C.
   NOTA: Il pellet di dsRNA non deve essere eccessivamente essiccato, poiché ciò potrebbe rendere difficile la risospensione completa. Per garantire una risospensione sufficiente, sono necessari almeno 2 volumi.
7. Controllo della quantità e della qualità del dsRNA: diluire il dsRNA in acqua priva di nucleasi in un rapporto compreso tra 1:100 e 1:300. Determinare la concentrazione di dsRNA utilizzando uno spettrofotometro a microvolumi (Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore. Per quantificare il dsRNA, moltiplicare la concentrazione per il volume. Per valutare la qualità del dsRNA, utilizzare l'elettroforesi su gel di agarosio. Preparare un gel di agarosio all'1% in 1x TAE e diluire il dsRNA a 1:50 con acqua priva di nucleasi. Utilizzare 5 μL di dsRNA diluito per corsia e colorare il gel con 0,5 mg/mL di bromuro di etidio per almeno 15 minuti per la visualizzazione.
   NOTA: il dsRNA migra più lentamente del dsDNA.

4. Preparazione delle nanoparticelle di chitosano/dsRNA

1. Preparare 100 mM di acetato di sodio (0,1 M NaC₂H₃O₂ e 0,1 M di acido acetico, pH 4,5 in acqua deionizzata) e 100 mM di solfato di sodio (100 mM Na₂SO₄ in acqua deionizzata) tampone a temperatura ambiente.
2. Sciogliere il chitosano commercializzato (da gusci di gamberetti, ≥75% deacetilato; Tabella dei materiali) in 100 mM di tampone di acetato di sodio per ottenere una soluzione di chitosano allo 0,02% (p/v).
3. Sciogliere 20 μg di dsRNA in 50 μL di acqua priva di nucleasi e aggiungerlo a 50 μL di tampone solfato di sodio 100 mM per ottenere una soluzione di dsRNA da 100 μL.
4. Aggiungere 100 μL di soluzione di chitosano a 100 μL di soluzione di dsRNA. Contemporaneamente, preparare un controllo aggiungendo 100 μL di soluzione di chitosano a 100 μL di 50 mM di solfato di sodio. Mescolare e scaldare i composti a 55 °C per 1 min.
5. Agitare immediatamente la miscela con un vortice ad alta velocità per 30 s per consentire la formazione delle nanoparticelle.
6. Centrifugare la miscela a 13.000 x g a temperatura ambiente per 10 minuti per ottenere un pellet bianco. Trasferire il surnatante in una provetta fresca da 1,5 mL. Lasciare asciugare il pellet all'aria a temperatura ambiente per 10 minuti.
7. Determinare la concentrazione di dsRNA nel surnatante utilizzando uno spettrofotometro a microvolumi (Tabella dei materiali). Utilizzare il surnatante del controllo come spazio vuoto. Moltiplicare la concentrazione per il volume per calcolare la quantità totale di dsRNA rimanente nel surnatante. Calcola la percentuale di dsRNA incapsulato nelle nanoparticelle per la quantità rimanente nel surnatante divisa per la quantità iniziale di dsRNA.
   NOTA: Anche se le nanoparticelle possono essere conservate per 4-37 °C per almeno 15 giorni prima dell'uso¹⁴, si consiglia di utilizzare le nanoparticelle il prima possibile.

5. Nutrire le larve del baco da seta con nanoparticelle di chitosano/dsRNA

1. Raccogli le larve di baco da seta del 5^° stadio appena mutate (cioè il giorno 1 del 5^° stadio) della stessa dimensione per l'esperimento di alimentazione. Posizionare le larve singolarmente in ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti prima di chiudere il coperchio e lasciarle morire di fame per 24 ore.
2. Sciacquare le foglie di gelso fresche con acqua deionizzata e asciugarle con carta da cucina pulita. Le foglie di gelso devono essere asciutte senza gocce d'acqua. Tagliare a dischi di foglie di gelso da 1 cm x 1 cm.
3. Sciogliere le nanoparticelle di chitosano/dsRNA in acqua priva di nucleasi a 500 ng/μL prima dell'uso. Diluire le nanoparticelle di chitosano di controllo (preparate in 4.4) con lo stesso volume di acqua priva di nucleasi. Preparare il dsRNA nudo a 500 ng/μL in acqua priva di nucleasi.
4. Utilizzare le nanoparticelle di chitosano/dsRNA per l'esperimento di knockdown dell'RNAi, le nanoparticelle di chitosano di controllo come controllo vuoto/negativo. Usa il dsRNA nudo per confrontare le differenze con le nanoparticelle di chitosano/dsRNA.
5. Rivestire 10 μL di nanoparticelle di chitosano/dsRNA, chitosano e dsRNA nudo sulla superficie di ciascun disco fogliare, rispettivamente. Asciugare all'aria la soluzione di nanoparticelle e la soluzione di dsRNA sui dischi fogliari a temperatura ambiente per 5 minuti.
6. Nutrire ogni larva con un disco fogliare rivestito di nanoparticelle o dsRNA al giorno. Fornire dischi fogliari rivestiti di nanoparticelle o dsRNA alle larve continuamente per 5 giorni. Le foglie di gelso fresche possono essere fornite dopo che il disco fogliare rivestito è stato completamente mangiato dalle larve ogni giorno.
7. Il giorno 6, anestetizzare le larve sul ghiaccio fino a quando non si muovono e sezionare le larve per il campionamento. Taglia il torace con le forbici su una capsula di Petri pulita. Estrarre l'intestino medio con una pinzetta. Rimuovere il contenuto nell'intestino medio e lavare l'intestino medio in un'altra capsula di Petri riempita con acqua priva di nucleasi. Conservare l'intestino medio in una provetta da 1,5 ml e mantenerlo a -70 °C.

6. Conferma del silenziamento genico

1. Eseguire la PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) per calcolare la quantificazione del trascritto relativo. Per ogni replica biologica sono richieste almeno tre repliche biologiche e tre repliche tecniche. Si raccomanda almeno due geni di riferimento per normalizzare il relativo trascritto. Viene testato un gene Bombyx Toll9-2 (BmToll9-2). Valutare l'efficienza del silenziamento genico confrontando il valore medio del trascritto relativo con il gruppo di controllo e convertirlo in percentuale.
   NOTA: La condizione di amplificazione della qRT-PCR, le informazioni sul primer e il relativo calcolo della trascrizione sono disponibili nella nostra recente pubblicazione²⁰.
2. Analizzare il fenotipo dell'RNAi per valutare l'effetto di silenziamento genico. Osserva le dimensioni delle larve e dei bozzoli. Scatta foto ogni giorno per registrare le apparizioni.
   NOTA: L'RNAi può influenzare la morfologia, la metamorfosi, la fisiologia e il comportamento. L'osservazione dei fenotipi correlati all'RNAi dipende dai geni bersaglio.

Risultati

Per valutare l'efficienza dell'RNAi, è stato scelto per l'analisi un gene immunitario che ha come bersaglio BmToll9-2 . Il gene BmToll9-2 è ben caratterizzato in laboratorio e il silenziamento genico mediante iniezione di dsRNA si traduce in larve più leggere e più piccole nella nostra recente pubblicazione²⁰. Per confermare l'efficacia dell'RNAi mediante ingestione attraverso nanoparticelle di chitosano/dsRNA, sono state utilizzate nanoparti...

Discussione

Uno stadio corretto è importante per l'osservazione del fenotipo dell'RNAi, a seconda dei geni bersaglio. I nostri risultati preliminari hanno mostrato che Toll9-2 è coinvolto nella crescita del baco da seta. Le dimensioni e il peso delle larve del baco da seta aumentano rapidamente al 5^{° stadio 21}. Pertanto, le larve del 5^° stadio sono selezionate come fase per l'esperimento di alimentazione di nanoparticelle di chitosano/dsRNA....

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tube	Sangon	F601620	for dsRNA or nanoparticles reaction
10 μl pipette	Eppendorf	P13473G	to aspirate or resuspend liquid
100 μl pipette	Eppendorf	Q12115G	to aspirate or resuspend liquid
2.5 μl pipette	Eppendorf	P20777G	to aspirate or resuspend liquid
20 μl pipette	Eppendorf	H19229E	to aspirate or resuspend liquid
200 μl pipette	Eppendorf	H20588E	to aspirate or resuspend liquid
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Costar	3516	for silkworm rearing individually
Acetic acid	Aladdin	A116165	to make TAE
Agarose M	BBI Life Sciences	A610013	for agarose gel electrophosis
Analytical balance	Sartorius	BSA224S	to weight ingredients
Centrifuge	Sartorius	Centrisart A-14C	to centrifuge to form dsRNA or nanoparticles
Chitosan	Sigma-Aldrich	C3646	to combine with dsRNA for preparation of nanoparticles
EDTA	Sangon	A500895	to make TAE
Ethanol	Aladdin	E130059	to make TAE, or for dsRNA precipitation
Freezer	Siemens	iQ300	to store dsRNA or nanoparticles
GoTaq Green Master Mix	Promega	M712	for PCR reaction
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6002	for qRT-PCR reaction
Isopropanol	Aladdin	I112011	for dsRNA precipitation
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher	One	to determine the concentration of dsRNA
ph meter	Sartorius	PB-10	to prepare buffers
SanPrep Column PCR Product Purification Kit	Sangon	B518141	for PCR product purification
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889	to make 100 mM sodium acetate buffer
Sodium sulfate	Sigma-Aldrich	239313	to make 100 mM sodium sulfate buffer
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	for dsRNA synthesis
ThermoMixer	Eppendorf	C	for dsRNA generation or nanoparticles heating
Tris	Sangon	A501492	to make TAE
Vortex	IKA	Vortex 3	to prepare chitosan/dsRNA nanoparticles