Interferenza dell'RNA larvale nel baco da seta Bombyx mori attraverso la somministrazione di nanoparticelle di chitosano/dsRNA

Riepilogo

Qui viene presentato un protocollo per la somministrazione di nanoparticelle di chitosano/dsRNA nelle larve di Bombyx mori del baco da seta per indurre il silenziamento genico attraverso l'ingestione.

Abstract

Il baco da seta, Bombyx mori, è un importante insetto economico con migliaia di anni di storia in Cina. Nel frattempo, il baco da seta è l'insetto modello dei lepidotteri con un buon accumulo di ricerche di base. È anche il primo insetto nei lepidotteri con il suo genoma completo sequenziato e assemblato, che fornisce una solida base per lo studio della funzionalità genica. Sebbene l'interferenza dell'RNA (RNAi) sia ampiamente utilizzata nello studio funzionale dei geni inversi, è refrattaria nei bachi da seta e in altre specie di lepidotteri. Precedenti ricerche di successo relative all'RNAi per fornire RNA a doppio filamento (dsRNA) sono state eseguite solo attraverso l'iniezione. La somministrazione di dsRNA attraverso l'alimentazione non viene mai riportata. In questo articolo, descriviamo le procedure passo dopo passo per preparare le nanoparticelle di chitosano/dsRNA, che vengono somministrate alle larve del baco da seta mediante ingestione. Il protocollo include (i) la selezione dello stadio corretto delle larve del baco da seta, (ii) la sintesi del dsRNA, (iii) la preparazione delle nanoparticelle di chitosano/dsRNA e (iv) l'alimentazione delle larve del baco da seta con nanoparticelle di chitosano/dsRNA. Vengono presentati risultati rappresentativi, tra cui la conferma del trascritto genico e l'osservazione del fenotipo. L'alimentazione del dsRNA è una tecnica semplice per l'RNAi nelle larve del baco da seta. Poiché le larve del baco da seta sono facili da allevare e abbastanza grandi da poter essere utilizzate, fornisce un buon modello per dimostrare l'RNAi larvale negli insetti. Inoltre, la semplicità di questa tecnica stimola un maggiore coinvolgimento degli studenti nella ricerca, rendendo le larve del baco da seta un sistema genetico ideale per l'uso in classe.

Introduzione

Il baco da seta, Bombyx mori, è un insetto addomesticato più di 5000 anni fa in Cina. Grazie alla sua capacità di produrre seta, il baco da seta è un importante insetto economico nell'agricoltura e nella sericoltura cinesi. Il baco da seta è secondo solo al moscerino della frutta come insetto modello. Come insetto modello nei lepidotteri, il baco da seta è facile da allevare, con un corpo di grandi dimensioni e molti mutanti. Nel frattempo, il baco da seta è il primo insetto lepidottero con il suo genoma completo sequenziato¹. Sono inoltre disponibili al pubblico molti database che forniscono informazi....

Protocollo

1. Specie di bachi da seta e allevamento

1. Allevare almeno 120 larve di baco da seta appena nate di 1^° stadio del ceppo P50 di B. mori con foglie di gelso fresche a 25 ± 1 °C, fotoperiodo 12 h Luce: 12 h Buio e 75% ± 5% di umidità relativa.

2. Selezione delle larve di baco da seta

1. Scegli il giorno 1 delle larve del 5^° stadio per l'esperimento RNAi; Le larve del baco da seta crescono velocemente dopo il giorno 3 del 5^{° stadio} , il che è l'ideale per confrontare le differenze nell'aspetto larvale.
   NOTA: In a....

Discussione

Uno stadio corretto è importante per l'osservazione del fenotipo dell'RNAi, a seconda dei geni bersaglio. I nostri risultati preliminari hanno mostrato che Toll9-2 è coinvolto nella crescita del baco da seta. Le dimensioni e il peso delle larve del baco da seta aumentano rapidamente al 5^{° stadio 21}. Pertanto, le larve del 5^° stadio sono selezionate come fase per l'esperimento di alimentazione di nanoparticelle di chitosano/dsRNA........

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tube	Sangon	F601620	for dsRNA or nanoparticles reaction
10 μl pipette	Eppendorf	P13473G	to aspirate or resuspend liquid
100 μl pipette	Eppendorf	Q12115G	to aspirate or resuspend liquid
2.5 μl pipette	Eppendorf	P20777G	to aspirate or resuspend liquid
20 μl pipette	Eppendorf	H19229E	to aspirate or resuspend liquid
200 μl pipette	Eppendorf	H20588E	to aspirate or resuspend liquid
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Costar	3516	for silkworm rearing individually
Acetic acid	Aladdin	A116165	to make TAE
Agarose M	BBI Life Sciences	A610013	for agarose gel electrophosis
Analytical balance	Sartorius	BSA224S	to weight ingredients
Centrifuge	Sartorius	Centrisart A-14C	to centrifuge to form dsRNA or nanoparticles
Chitosan	Sigma-Aldrich	C3646	to combine with dsRNA for preparation of nanoparticles
EDTA	Sangon	A500895	to make TAE
Ethanol	Aladdin	E130059	to make TAE, or for dsRNA precipitation
Freezer	Siemens	iQ300	to store dsRNA or nanoparticles
GoTaq Green Master Mix	Promega	M712	for PCR reaction
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6002	for qRT-PCR reaction
Isopropanol	Aladdin	I112011	for dsRNA precipitation
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher	One	to determine the concentration of dsRNA
ph meter	Sartorius	PB-10	to prepare buffers
SanPrep Column PCR Product Purification Kit	Sangon	B518141	for PCR product purification
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889	to make 100 mM sodium acetate buffer
Sodium sulfate	Sigma-Aldrich	239313	to make 100 mM sodium sulfate buffer
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	for dsRNA synthesis
ThermoMixer	Eppendorf	C	for dsRNA generation or nanoparticles heating
Tris	Sangon	A501492	to make TAE
Vortex	IKA	Vortex 3	to prepare chitosan/dsRNA nanoparticles