Interferência de RNA Larval no Bicho-da-Seda Bombyx mori por meio da Entrega de Nanopartículas de Quitosana/dsRNA

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para entrega de nanopartículas de quitosana/dsRNA em larvas de Bombyx mori de bicho-da-seda para induzir o silenciamento de genes por ingestão.

Resumo

O bicho-da-seda, Bombyx mori, é um importante inseto econômico com milhares de anos de história na China. Enquanto isso, o bicho-da-seda é o inseto modelo de lepidópteros com um bom acúmulo de pesquisa básica. É também o primeiro inseto em lepidópteros com seu genoma completo sequenciado e montado, o que fornece uma base sólida para o estudo funcional do gene. Embora a interferência de RNA (RNAi) seja amplamente utilizada no estudo funcional do gene reverso, ela é refratária em bichos-da-seda e outras espécies de lepidópteros. Pesquisas anteriores bem-sucedidas relacionadas ao RNAi para fornecer RNA de fita dupla (dsRNA) foram realizadas apenas por injeção. A entrega de dsRNA por meio da alimentação nunca é relatada. Neste artigo, descrevemos procedimentos passo a passo para preparar as nanopartículas de quitosana/dsRNA, que são alimentadas com as larvas do bicho-da-seda por ingestão. O protocolo inclui (i) seleção do estágio adequado das larvas do bicho-da-seda, (ii) síntese de dsRNA, (iii) preparação das nanopartículas de quitosana/dsRNA e (iv) alimentação das larvas do bicho-da-seda com nanopartículas de quitosana/dsRNA. Resultados representativos, incluindo confirmação de transcrição gênica e observação de fenótipo, são apresentados. A alimentação com dsRNA é uma técnica simples para RNAi em larvas de bicho-da-seda. Como as larvas do bicho-da-seda são fáceis de criar e grandes o suficiente para operar, ele fornece um bom modelo para demonstrar o RNAi larval em insetos. Além disso, a simplicidade dessa técnica estimula mais o envolvimento dos alunos na pesquisa, tornando as larvas do bicho-da-seda um sistema genético ideal para uso em sala de aula.

Introdução

O bicho-da-seda, Bombyx mori, é um inseto domesticado há mais de 5000 anos na China. Devido à sua capacidade de produzir seda, o bicho-da-seda é um importante inseto econômico na agricultura e sericultura chinesas. O bicho-da-seda perde apenas para a mosca da fruta como inseto modelo. Como um inseto modelo em lepidópteros, o bicho-da-seda é fácil de criar, com um grande tamanho corporal e muitos mutantes. Enquanto isso, o bicho-da-seda é o primeiro inseto lepidóptero com seu genoma completo sequenciado¹. Muitos bancos de dados que fornecem informações para o genoma², transcriptoma³, etiqueta de sequência expressa (EST)⁴, RNA não codificante⁵ e microssatélite⁶ também estão disponíveis ao público. Os fatos acima tornam o bicho-da-seda um modelo perfeito para a pesquisa genética.

A interferência de RNA (RNAi) é um processo celular no qual moléculas de RNA de fita dupla (dsRNA) se ligam e cortam o RNA mensageiro complementar (mRNA), alcançando assim o efeito silenciador do gene alvo. Esse mecanismo está naturalmente presente nas bactérias para se defender contra a invasão de vírus⁷. Mais tarde, descobriu-se que o RNAi é conservado em animais, plantas e micróbios. Devido ao seu poderoso efeito de silenciamento específico da sequência, o RNAi é usado em pesquisas fundamentais para manipular a expressão gênica e estudar a função do gene. O RNAi é obtido através da entrega de dsRNA nas células.

Nos insetos, existem três maneiras comuns de fornecer dsRNA, que são microinjeção, alimentação e imersão⁸. No momento, relatórios de RNAi bem-sucedidos nos bichos-da-seda por meio da entrega de dsRNA nu são conduzidos por injeção de dsRNA⁹. As vantagens da microinjeção são a entrega imediata de dsRNA na hemolinfa e o controle preciso da quantidade de dsRNA. No entanto, também existem certas desvantagens da microinjeção. Por exemplo, é demorado e requer dispositivos delicados. Também é importante otimizar as agulhas de injeção, o volume de injeção e a quantidade de dsRNA. Portanto, uma maneira alternativa de entregar dsRNA aos bichos-da-seda torna-se necessária. Como o exoesqueleto de um inseto é uma barreira à prova d'água feita de quitina, a imersão de larvas de insetos para obter RNAi raramente é relatada, o que não é uma boa opção para RNAi em insetos. A alimentação de dsRNA economiza mão de obra, é econômica e fácil de realizar¹⁰. Este método também é aplicável para triagem genética de alto rendimento¹¹. No entanto, verificou-se que uma nuclease não específica de DNA / RNA, ou seja, BmdsRNase, está presente no suco do intestino médio e do intestino médio das larvas do bicho-da-seda¹². Esta nuclease é mostrada para digerir dsRNA, de preferência¹³. Portanto, alimentar o bicho-da-seda com dsRNA nu para silenciar a expressão gênica parece ser difícil.

Recentemente, o dsRNA blindado com nanopartículas provou ser uma boa alternativa para aumentar a eficiência do RNAi por meio da alimentação^{de 14}. A quitosana é um polímero barato, não tóxico e biodegradável, que pode ser preparado por desacetilação da quitina, um biopolímero natural e o segundo mais abundante depois da celulose¹⁵. Como o grupo amino na quitosana é carregado positivamente e o grupo fosfato na espinha dorsal do dsRNA é carregado negativamente, as nanopartículas de quitosana / dsRNA podem ser formadas pela automontagem de policátions¹⁶. As nanopartículas de quitosana/dsRNA são eficazes na obtenção de RNAi por meio da alimentação larval em mosquitos Aedes aegypti e Anopheles gambiae¹⁷, lagarta manchada de algodão Earias vittella¹⁸ e ácaro-aranha carmim Tetranychus cinnabarinus¹⁹.

A fim de desenvolver uma metodologia para a entrega de dsRNA alimentando-se em bichos-da-seda para obter eficiência de RNAi bem-sucedida, este relatório se concentra na descrição de procedimentos passo a passo sobre como preparar as nanopartículas de quitosana/dsRNA e alimentar as nanopartículas para as larvas do bicho-da-seda. Essa metodologia é relativamente barata, economiza mão de obra e é fácil de seguir, que pode ser adaptada para estudos de silenciamento de genes em outros insetos. Nosso objetivo é fornecer um protocolo mais fácil para o método de entrega de dsRNA de lepidópteros com maior eficiência de RNAi.

Protocolo

1. Espécies e criação do bicho-da-seda

1. Atrás pelo menos 120 larvas de bicho-da-seda de^1º ínstar recém-eclodidas da cepa B . mori P50 com folhas frescas de amoreira a 25 ± 1 ° C, fotoperíodo 12 h Claro: 12 h Escuro e 75% ± 5% de umidade relativa.

2. Seleção de larvas de bicho-da-seda

1. Escolha o dia 1 das larvas de^5º ínstar para o experimento de RNAi; As larvas do bicho-da-seda crescem rapidamente após o dia 3 do^5º ínstar, o que é ideal para comparar as diferenças na aparência larval.
   NOTA: Alternativamente, estágios mais jovens, como o^3º ou^4º ínstar, podem ser usados para o experimento de RNAi. No entanto, requer tratamento constante com dsRNA até o^5º ínstar, o que é relativamente caro e custado por material.

3. Síntese de dsRNA

1. Identificação do fragmento alvo do dsRNA: Selecione a sequência codificadora de um gene alvo e alinhe-a com outros genes homólogos para determinar a região conservada. Projete primers específicos de genes na região não conservada para amplificação subsequente do fragmento alvo de dsRNA. Para experimentos de RNAi em insetos, o fragmento alvo típico de dsRNA é geralmente de 400-600 pb. O tamanho mínimo pode ser de 200 pb.
   NOTA: Para melhorar a eficiência e a taxa de sucesso dos experimentos de RNAi, algumas ferramentas baseadas na web podem ser usadas para projetar o alvo de dsRNA, como o dsRNA Engineer (https://dsrna-engineer.cn/).
2. Produzindo modelo de produto de PCR: Adicione um promotor de RNA polimerase T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3') à extremidade 5' de qualquer primer projetado acima. Execute PCR padrão para amplificar o fragmento alvo de dsRNA. Execute um gel de agarose a 1% em 1x TAE para verificar um único produto de PCR do tamanho esperado. Depois disso, purifique o produto de PCR com um kit de purificação (Tabela de Materiais) e use-o para transcrição subsequente.
   NOTA: Para armazenar o produto de PCR alvo a longo prazo e obter altos rendimentos, sugere-se ligar o produto de PCR a um plasmídeo. O plasmídeo deve ser linearizado antes da reação de PCR.
3. Geração de dsRNA: Use um sistema T7 RNAi (Tabela de Materiais) para gerar o dsRNA. Configure a reação adicionando os componentes à temperatura ambiente de acordo com as instruções do fabricante. Misturar a reação pipetando suavemente e incubar a 37 °C durante 30 min.
   NOTA: Para maximizar o rendimento, a incubação a 37 °C pode ser estendida até 2-6 h. Para modelos contendo uma estrutura secundária ou rica em GC, a incubação pode ser realizada a 42 °C para melhorar o rendimento do dsRNA.
4. Recozimento para formar dsRNA: Incube a reação a 70 ° C por 10 min e, em seguida, resfrie lentamente até a temperatura ambiente (~ 20 min). Isso irá recozer o dsRNA.
5. Tratamento de DNase e RNase: Pipetar 1 μL da solução de RNase fornecida para 199 μL de água livre de nuclease para fazer uma solução de RNase recém-diluída. Adicione 1 μL de solução de RNase recém-diluída e 1 μL da DNase livre de RNase RQ1 fornecida por 20 μL de volume de reação, misture suavemente e incube a 37 ° C por 30 min. O RNA de fita simples (ssRNA) e o DNA molde na reação serão removidos após este tratamento.
6. Precipitação alcoólica: Adicione 1 volume de isopropanol ou 2,5 volumes de etanol a 95% junto com 0,1 volume de acetato de sódio 3 M (pH 5,2) à reação. Misture a reação por vórtice e incube no gelo por 5 min para formar uma massa turva. Gire na velocidade máxima em uma centrífuga por 10 min para coletar um pellet branco no fundo do tubo. Descarte o sobrenadante e lave o pellet com 0,5 mL de etanol frio a 70% para remover o sal residual. Remova o etanol após a lavagem. Deixe o pellet secar ao ar livre em temperatura ambiente por 15 min. Ressuspenda o pellet com água livre de nuclease em 2-5 vezes o volume inicial da reação. Conservar a -20 °C ou -70 °C.
   NOTA: O pellet de dsRNA não deve ser excessivamente seco, pois isso pode dificultar a ressuspensão total. Para garantir uma ressuspensão suficiente, são necessários no mínimo 2 volumes.
7. Verificação da quantidade e qualidade do dsRNA: Diluir o dsRNA em água livre de nuclease na proporção de 1:100 a 1:300. Determinar a concentração de dsRNA utilizando um espectrofotómetro de microvolume (Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante. Para quantificar o dsRNA, multiplique a concentração pelo volume. Para avaliar a qualidade do dsRNA, use eletroforese em gel de agarose. Prepare um gel de agarose a 1% em 1x TAE e dilua o dsRNA a 1:50 com água livre de nuclease. Use 5 μL de dsRNA diluído por pista e core o gel em brometo de etídio de 0,5 mg / mL por pelo menos 15 min para visualização.
   NOTA: o dsRNA migra mais lentamente do que o dsDNA.

4. Preparação das nanopartículas de quitosana/dsRNA

1. Faça 100 mM de acetato de sódio (0,1 M NaC₂H₃O₂ e 0,1 M de ácido acético, pH 4,5 em água deionizada) e 100 mM de sulfato de sódio (100 mM Na₂SO₄ em água deionizada) tampão à temperatura ambiente.
2. Dissolva a quitosana comercializada (de cascas de camarão, ≥75% desacetilada; Tabela de Materiais) em tampão de acetato de sódio 100 mM para fazer uma solução de quitosana a 0,02% (p / v).
3. Dissolva 20 μg de dsRNA em 50 μL de água livre de nuclease e adicione-o a 50 μL de tampão sulfato de sódio 100 mM para fazer uma solução de dsRNA de 100 μL.
4. Adicione 100 μL de solução de quitosana a 100 μL de solução de dsRNA. Simultaneamente, prepare um controle adicionando 100 μL de solução de quitosana a 100 μL de sulfato de sódio 50 mM. Misture e aqueça as misturas a 55 °C por 1 min.
5. Vortex a mistura imediatamente com um vórtice de alta velocidade por 30 s para permitir a formação das nanopartículas.
6. Centrifugue a mistura a 13.000 x g à temperatura ambiente por 10 min para obter um pellet branco. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 ml. Deixe o pellet secar ao ar livre em temperatura ambiente por 10 min.
7. Determinar a concentração de dsRNA no sobrenadante utilizando um espectrofotómetro de microvolume (Tabela de Materiais). Use o sobrenadante do controle como um espaço em branco. Multiplique a concentração pelo volume para calcular a quantidade total de dsRNA restante no sobrenadante. Calcule a porcentagem de dsRNA encapsulada nas nanopartículas pela quantidade restante no sobrenadante dividida pela quantidade inicial de dsRNA.
   NOTA: Embora as nanopartículas possam ser mantidas por 4-37 °C por pelo menos 15 dias antes do uso¹⁴, sugere-se o uso das nanopartículas o mais rápido possível.

5. Alimentando as larvas do bicho-da-seda com nanopartículas de quitosana/dsRNA

1. Escolha larvas de bicho-da-seda de^5º ínstar recém-mudadas (ou seja, Dia 1 do^5º ínstar) do mesmo tamanho para o experimento de alimentação. Coloque as larvas individualmente em cada poço de uma placa de 6 poços antes de fechar a tampa e morrer de fome por 24 h.
2. Lave as folhas frescas de amoreira com água deionizada e seque-as com papel de cozinha limpo. As folhas da amoreira devem estar secas sem gotas de água. Corte em discos de folhas de amoreira de 1 cm x 1 cm.
3. Dissolva as nanopartículas de quitosana/dsRNA em água livre de nuclease a 500 ng/μL antes de usar. Diluir as nanopartículas de quitosana de controlo (preparadas em 4.4) com o mesmo volume de água isenta de nuclease. Prepare dsRNA nu a 500 ng/μL em água livre de nuclease.
4. Use as nanopartículas de quitosana/dsRNA para o experimento de knockdown de RNAi, as nanopartículas de quitosana de controle como um controle em branco/negativo. Use o dsRNA nu para comparar as diferenças com as nanopartículas de quitosana/dsRNA.
5. Cubra 10 μL de nanopartículas de quitosana/dsRNA, quitosana e dsRNA nu na superfície de cada disco foliar, respectivamente. Seque ao ar a solução de nanopartículas e a solução de dsRNA nos discos foliares à temperatura ambiente por 5 min.
6. Alimente cada larva com um disco foliar revestido com nanopartículas ou dsRNA por dia. Forneça discos foliares revestidos com nanopartículas ou revestidos com dsRNA para as larvas continuamente por 5 dias. Folhas frescas de amoreira podem ser fornecidas depois que o disco foliar revestido é totalmente comido pelas larvas todos os dias.
7. No dia 6, anestesiar as larvas no gelo até que não se movam e dissecar as larvas para amostragem. Corte o tórax com uma tesoura em uma placa de Petri limpa. Puxe o intestino médio com uma pinça. Remova o conteúdo do intestino médio e lave o intestino médio em outra placa de Petri cheia de água livre de nuclease. Armazenar o intestino médio num tubo de 1,5 ml e conservar a -70 °C.

6. Confirmação do silenciamento gênico

1. Realize PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) para calcular a quantificação relativa do transcrito. São necessários, pelo menos, três réplicas biológicas e três réplicas técnicas para cada réplica biológica. Pelo menos dois genes de referência são recomendados para normalizar o transcrito relativo. Um gene Bombyx Toll9-2 (BmToll9-2) é testado. Avalie a eficiência do silenciamento do gene comparando o valor médio do transcrito relativo ao grupo de controle e converta-o em porcentagem.
   NOTA: A condição de amplificação de qRT-PCR, informações do primer e cálculo relativo do transcrito podem ser encontrados em nossa publicação recente²⁰.
2. Analise o fenótipo de RNAi para avaliar o efeito de silenciamento gênico. Observe o tamanho das larvas e casulos. Tire fotos diariamente para registrar as aparições.
   NOTA: O RNAI pode afetar a morfologia, metamorfose, fisiologia e comportamento. A observação de fenótipos relacionados ao RNAi depende dos genes visados.

Resultados

Para avaliar a eficiência do RNAi, um gene imune direcionado ao BmToll9-2 foi escolhido para análise. O gene BmToll9-2 é bem caracterizado em laboratório, e o silenciamento gênico por injeção de dsRNA resulta em larvas mais leves e menores em nossa recente publicação²⁰. Para confirmar a eficácia do RNAi por ingestão através de nanopartículas de quitosana/dsRNA, nanopartículas de quitosana foram usadas como controle, e o dsRNA nu foi...

Discussão

Um estágio adequado é importante para a observação do fenótipo de RNAi, dependendo dos genes visados. Nossos resultados preliminares mostraram que Toll9-2 está envolvido no crescimento do bicho-da-seda. O tamanho e o peso das larvas do bicho-da-seda aumentam rapidamente no^5º ínstar²¹. Portanto, as larvas de^5º ínstar são selecionadas como palco para o experimento de alimentação de nanopartículas de quitosana/dsRNA. Tamb?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tube	Sangon	F601620	for dsRNA or nanoparticles reaction
10 μl pipette	Eppendorf	P13473G	to aspirate or resuspend liquid
100 μl pipette	Eppendorf	Q12115G	to aspirate or resuspend liquid
2.5 μl pipette	Eppendorf	P20777G	to aspirate or resuspend liquid
20 μl pipette	Eppendorf	H19229E	to aspirate or resuspend liquid
200 μl pipette	Eppendorf	H20588E	to aspirate or resuspend liquid
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Costar	3516	for silkworm rearing individually
Acetic acid	Aladdin	A116165	to make TAE
Agarose M	BBI Life Sciences	A610013	for agarose gel electrophosis
Analytical balance	Sartorius	BSA224S	to weight ingredients
Centrifuge	Sartorius	Centrisart A-14C	to centrifuge to form dsRNA or nanoparticles
Chitosan	Sigma-Aldrich	C3646	to combine with dsRNA for preparation of nanoparticles
EDTA	Sangon	A500895	to make TAE
Ethanol	Aladdin	E130059	to make TAE, or for dsRNA precipitation
Freezer	Siemens	iQ300	to store dsRNA or nanoparticles
GoTaq Green Master Mix	Promega	M712	for PCR reaction
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6002	for qRT-PCR reaction
Isopropanol	Aladdin	I112011	for dsRNA precipitation
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher	One	to determine the concentration of dsRNA
ph meter	Sartorius	PB-10	to prepare buffers
SanPrep Column PCR Product Purification Kit	Sangon	B518141	for PCR product purification
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889	to make 100 mM sodium acetate buffer
Sodium sulfate	Sigma-Aldrich	239313	to make 100 mM sodium sulfate buffer
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	for dsRNA synthesis
ThermoMixer	Eppendorf	C	for dsRNA generation or nanoparticles heating
Tris	Sangon	A501492	to make TAE
Vortex	IKA	Vortex 3	to prepare chitosan/dsRNA nanoparticles