Интерференция личиночной РНК у шелкопряда Bombyx mori через доставку наночастиц хитозана/дцРНК

Резюме

Здесь представлен протокол доставки наночастиц хитозана/дцРНК в личинки тутового шелкопряда Bombyx mori с целью индуцирования сайленсинга генов при проглатывании.

Аннотация

Шелкопряд, Bombyx mori, является важным экономическим насекомым с тысячелетней историей в Китае. Между тем, шелкопряд является модельным насекомым чешуекрылых с хорошим накоплением фундаментальных исследований. Это также первое насекомое из семейства чешуекрылых, полный геном которого секвенирован и собран, что обеспечивает прочную основу для изучения функциональности генов. Несмотря на то, что РНК-интерференция (РНК-интерференция) широко используется в исследовании обратной функциональности генов, она является рефрактерной у шелкопрядов и других видов чешуекрылых. Предыдущие успешные исследования, связанные с РНК-интерференцией для доставки двухцепочечной РНК (дцРНК), проводились только путем инъекций. О доставке дцРНК через питание никогда не сообщается. В этой статье мы описываем пошаговые процедуры получения наночастиц хитозана/дцРНК, которые скармливаются личинкам тутового шелкопряда при приеме внутрь. Протокол включает в себя (i) выбор правильной стадии личинок тутового шелкопряда, (ii) синтез дцРНК, (iii) получение наночастиц хитозана/дцРНК и (iv) кормление личинок тутового шелкопряда наночастицами хитозана/дцРНК. Представлены репрезентативные результаты, включая подтверждение транскриптов генов и наблюдение за фенотипом. Кормление дцРНК является простым методом получения РНК-интерференции у личинок тутового шелкопряда. Поскольку личинки тутового шелкопряда просты в выращивании и достаточно велики для работы, это является хорошей моделью для демонстрации личиночной РНК-интерференции у насекомых. Кроме того, простота этого метода стимулирует более активное участие студентов в исследованиях, что делает личинок тутового шелкопряда идеальной генетической системой для использования в классе.

Введение

Шелкопряд, Bombyx mori, является насекомым, одомашненным более 5000 лет назад в Китае. Благодаря своей способности производить шелк, шелкопряд является важным экономическим насекомым в китайском сельском хозяйстве и шелководстве. Шелкопряд уступает только плодовой мухе в качестве модельного насекомого. В качестве образцового насекомого у чешуекрылых, шелкопряда легко выращивать, он имеет большой размер тела и большое количество мутантов. Между тем, шелкопряд является первым чешуекрылым насекомым с секвенированным полным^{геномом1}. Также доступно множество баз данных, предоставляющих информацию о геноме

протокол

1. Виды и выращивание тутового шелкопряда

1. Вырастите не менее 120 только что вылупившихся личинок шелкопряда^1-го возраста штамма B. mori P50 со свежими листьями шелковицы при температуре 25 ± 1 °C, фотопериоде 12 ч Свет: 12 ч в темноте и относительной влажности 75% ± 5%.

2. Отбор личинок тутового шелкопряда

1. Выберите день 1 личинки^5-го возраста для эксперимента с РНК-интерференцией; Личинки шелкопряда быстро растут после 3-го дня^5-го возраста, что идеально подходит для сравнения различий во внешнем виде личин....

Результаты

Для оценки эффективности РНК-интерференции для анализа был выбран иммунный ген, нацеленный на BmToll9-2 . Ген BmToll9-2 хорошо охарактеризован в лаборатории, а подавление экспрессии генов путем инъекции дцРНК приводит к получению более легких и мелких личинок в наше.......

Обсуждение

Для наблюдения за фенотипом РНК-интерференции важен правильный этап, в зависимости от целевых генов. Наши предварительные результаты показали, что Toll9-2 участвует в росте шелкопряда. Размер и масса личинок тутового шелкопряда быстро увеличиваются в^5-м возра.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tube	Sangon	F601620	for dsRNA or nanoparticles reaction
10 μl pipette	Eppendorf	P13473G	to aspirate or resuspend liquid
100 μl pipette	Eppendorf	Q12115G	to aspirate or resuspend liquid
2.5 μl pipette	Eppendorf	P20777G	to aspirate or resuspend liquid
20 μl pipette	Eppendorf	H19229E	to aspirate or resuspend liquid
200 μl pipette	Eppendorf	H20588E	to aspirate or resuspend liquid
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Costar	3516	for silkworm rearing individually
Acetic acid	Aladdin	A116165	to make TAE
Agarose M	BBI Life Sciences	A610013	for agarose gel electrophosis
Analytical balance	Sartorius	BSA224S	to weight ingredients
Centrifuge	Sartorius	Centrisart A-14C	to centrifuge to form dsRNA or nanoparticles
Chitosan	Sigma-Aldrich	C3646	to combine with dsRNA for preparation of nanoparticles
EDTA	Sangon	A500895	to make TAE
Ethanol	Aladdin	E130059	to make TAE, or for dsRNA precipitation
Freezer	Siemens	iQ300	to store dsRNA or nanoparticles
GoTaq Green Master Mix	Promega	M712	for PCR reaction
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6002	for qRT-PCR reaction
Isopropanol	Aladdin	I112011	for dsRNA precipitation
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher	One	to determine the concentration of dsRNA
ph meter	Sartorius	PB-10	to prepare buffers
SanPrep Column PCR Product Purification Kit	Sangon	B518141	for PCR product purification
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889	to make 100 mM sodium acetate buffer
Sodium sulfate	Sigma-Aldrich	239313	to make 100 mM sodium sulfate buffer
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	for dsRNA synthesis
ThermoMixer	Eppendorf	C	for dsRNA generation or nanoparticles heating
Tris	Sangon	A501492	to make TAE
Vortex	IKA	Vortex 3	to prepare chitosan/dsRNA nanoparticles