Интерференция личиночной РНК у шелкопряда Bombyx mori через доставку наночастиц хитозана/дцРНК

Резюме

Здесь представлен протокол доставки наночастиц хитозана/дцРНК в личинки тутового шелкопряда Bombyx mori с целью индуцирования сайленсинга генов при проглатывании.

Аннотация

Шелкопряд, Bombyx mori, является важным экономическим насекомым с тысячелетней историей в Китае. Между тем, шелкопряд является модельным насекомым чешуекрылых с хорошим накоплением фундаментальных исследований. Это также первое насекомое из семейства чешуекрылых, полный геном которого секвенирован и собран, что обеспечивает прочную основу для изучения функциональности генов. Несмотря на то, что РНК-интерференция (РНК-интерференция) широко используется в исследовании обратной функциональности генов, она является рефрактерной у шелкопрядов и других видов чешуекрылых. Предыдущие успешные исследования, связанные с РНК-интерференцией для доставки двухцепочечной РНК (дцРНК), проводились только путем инъекций. О доставке дцРНК через питание никогда не сообщается. В этой статье мы описываем пошаговые процедуры получения наночастиц хитозана/дцРНК, которые скармливаются личинкам тутового шелкопряда при приеме внутрь. Протокол включает в себя (i) выбор правильной стадии личинок тутового шелкопряда, (ii) синтез дцРНК, (iii) получение наночастиц хитозана/дцРНК и (iv) кормление личинок тутового шелкопряда наночастицами хитозана/дцРНК. Представлены репрезентативные результаты, включая подтверждение транскриптов генов и наблюдение за фенотипом. Кормление дцРНК является простым методом получения РНК-интерференции у личинок тутового шелкопряда. Поскольку личинки тутового шелкопряда просты в выращивании и достаточно велики для работы, это является хорошей моделью для демонстрации личиночной РНК-интерференции у насекомых. Кроме того, простота этого метода стимулирует более активное участие студентов в исследованиях, что делает личинок тутового шелкопряда идеальной генетической системой для использования в классе.

Введение

Шелкопряд, Bombyx mori, является насекомым, одомашненным более 5000 лет назад в Китае. Благодаря своей способности производить шелк, шелкопряд является важным экономическим насекомым в китайском сельском хозяйстве и шелководстве. Шелкопряд уступает только плодовой мухе в качестве модельного насекомого. В качестве образцового насекомого у чешуекрылых, шелкопряда легко выращивать, он имеет большой размер тела и большое количество мутантов. Между тем, шелкопряд является первым чешуекрылым насекомым с секвенированным полным^{геномом1}. Также доступно множество баз данных, предоставляющих информацию о геноме², транскриптоме³, метке экспрессированной последовательности (EST)⁴, некодирующей РНК⁵ и микросателлите⁶ . Вышеперечисленные факты делают шелкопряда идеальной моделью для генетических исследований.

РНК-интерференция (РНК-интерференция) — это клеточный процесс, при котором молекулы двухцепочечной РНК (дцРНК) связываются и разрезают комплементарную матричную РНК (мРНК), тем самым достигая эффекта сайленсинга гена-мишени. Этот механизм естественным образом присутствует у бактерий для защиты от вторжения вирусов⁷. Позже было обнаружено, что РНК-интерференция сохраняется у животных, растений и микробов. Благодаря своему мощному эффекту сайленсинга, специфичному для определенной последовательности, РНК-интерференция используется в фундаментальных исследованиях для манипулирования экспрессией генов и изучения их функций. РНК-интерференция достигается за счет доставки дцРНК в клетки.

У насекомых существует три распространенных способа доставки дцРНК: микроинъекция, кормление и замачивание⁸. В настоящее время успешные сообщения о РНК-интерференции у шелкопрядов через доставку голой дцРНК осуществляются путем введения дцРНК⁹. Преимуществами микроинъекций являются немедленная доставка дцРНК в гемолимфу и точный контроль количества дцРНК. Однако существуют и определенные недостатки микроинъекций. Например, это трудоемко, и для этого требуются деликатные устройства. Также важно оптимизировать инъекционные иглы, объем инъекций и количество дцРНК. Поэтому становится необходимым альтернативный способ доставки дцРНК к шелкопрядам. Поскольку экзоскелет насекомого представляет собой водонепроницаемый барьер, состоящий из хитина, о замачивании личинок насекомых для получения РНК-интерференции сообщается редко, что не является хорошим вариантом для РНК-интерференции у насекомых. Кормление дцРНК является трудоемким, экономичным и простым в выполнении¹⁰. Этот метод также применим для высокопроизводительного скрининга генов¹¹. Тем не менее, было обнаружено, что неспецифическая нуклеаза ДНК/РНК, а именно BmdsРНКаза, присутствует в средней кишке и соке средней кишки личинок тутового шелкопряда¹². Показано, что эта нуклеаза переваривает дцРНК, предпочтительно¹³. Таким образом, скармливание тутового шелкопряда голой дцРНК для подавления экспрессии генов представляется сложной задачей.

Недавно было доказано, что дцРНК, защищенная наночастицами, является хорошей альтернативой для повышения эффективности РНК-интерференции за счет кормления¹⁴. Хитозан является недорогим, нетоксичным и биоразлагаемым полимером, который может быть получен путем деацетилирования хитина, природного и второго по распространенности биополимера после целлюлозы¹⁵. Поскольку аминогруппа в хитозане заряжена положительно, а фосфатная группа на основе дцРНК заряжена отрицательно, наночастицы хитозана/дцРНК могут быть образованы путем самосборки поликатионов¹⁶. Наночастицы хитозана/дцРНК эффективны в достижении РНК-интерференции за счет питания личинок комаров Aedes aegypti и Anopheles gambiae¹⁷, хлопчатникового пятнистого коробочного червя Earias vittella¹⁸ и карминного паутинного клеща Tetranychus cinnabarinus¹⁹.

Чтобы разработать методологию доставки дцРНК путем кормления шелковичных червей для достижения успешной эффективности РНК-интерференции, в этом отчете основное внимание уделяется описанию пошаговых процедур получения наночастиц хитозана/дцРНК и скармливания наночастиц личинкам тутового шелкопряда. Эта методология относительно недорога, трудосберегательна и проста в использовании, которая может быть адаптирована для исследований подавления генов у других насекомых. Мы стремимся предоставить более простой протокол для метода доставки дцРНК чешуекрылых с более высокой эффективностью РНК-интерференции.

протокол

1. Виды и выращивание тутового шелкопряда

1. Вырастите не менее 120 только что вылупившихся личинок шелкопряда^1-го возраста штамма B. mori P50 со свежими листьями шелковицы при температуре 25 ± 1 °C, фотопериоде 12 ч Свет: 12 ч в темноте и относительной влажности 75% ± 5%.

2. Отбор личинок тутового шелкопряда

1. Выберите день 1 личинки^5-го возраста для эксперимента с РНК-интерференцией; Личинки шелкопряда быстро растут после 3-го дня^5-го возраста, что идеально подходит для сравнения различий во внешнем виде личинок.
   Примечание: В качестве альтернативы, более молодые стадии, такие как^3-й или^4-й возраст, могут быть использованы для эксперимента с РНК-интерференцией. Тем не менее, она требует постоянной обработки дцРНК до^5-го возраста, что относительно дорого и требует материальных затрат.

3. Синтез дцРНК

1. Идентификация фрагмента-мишени дцРНК: выберите кодирующую последовательность гена-мишени и выровняйте ее с другими гомологичными генами для определения консервативной области. Спроектируйте ген-специфичные праймеры в неконсервативном участке для последующей амплификации фрагмента-мишени дцРНК. Для экспериментов с РНК-интерференцией у насекомых типичный фрагмент-мишень дцРНК обычно составляет 400-600.н. Минимальный размер может составлять 200.о.
   Примечание: Для повышения эффективности и успешности экспериментов с РНК-интерференцией для разработки мишени дцРНК можно использовать некоторые веб-инструменты, такие как dsRNA Engineer (https://dsrna-engineer.cn/).
2. Шаблон продукта для производства ПЦР: Добавьте промотор РНК-полимеразы T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3') на 5'-конец любого праймера, разработанного выше. Проведите стандартную ПЦР для амплификации фрагмента-мишени дцРНК. Запустите 1% агарозный гель в 1x TAE, чтобы проверить один продукт ПЦР ожидаемого размера. После этого очистите продукт ПЦР с помощью очистительного набора (Table of Materials) и используйте его для последующей транскрипции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для длительного хранения целевого ПЦР-продукта и получения высоких урожаев рекомендуется лигировать ПЦР-продукт до плазмиды. Плазмида должна быть линеаризирована перед реакцией ПЦР.
3. Генерация дцРНК: Используйте систему T7 RNAi (Таблица материалов) для генерации дцРНК. Настройте реакцию, добавив компоненты при комнатной температуре в соответствии с инструкциями производителя. Осторожно перемешайте реакцию с помощью пипетки и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для максимального увеличения выхода инкубация при 37 °C может быть продлена до 2-6 часов. Для матриц, содержащих вторичную структуру или богатых GC, инкубацию можно проводить при температуре 42 °C для увеличения выхода дцРНК.
4. Отжиг с образованием дцРНК: Инкубировать реакцию при 70 °C в течение 10 минут, затем медленно охладить до комнатной температуры (~20 минут). Это приведет к отжигу дцРНК.
5. Обработка ДНКазы и РНКазы: пипетка 1 мкл подаваемого раствора РНКазы в 199 мкл воды, не содержащей нуклеаз, чтобы получить свежеразведенный раствор РНКазы. Добавьте 1 мкл свежеразведенного раствора РНКазы и 1 мкл поставляемой ДНКазы, не содержащей RQ1 РНКазы, на 20 мкл реакционного объема, аккуратно перемешайте и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут. Одноцепочечная РНК (ссРНК) и матричная ДНК в реакции будут удалены после этой обработки.
6. Осаждение спирта: Добавьте в реакцию 1 объем изопропанола или 2,5 объема 95% этанола вместе с 0,1 объема 3 М ацетата натрия (pH 5,2). Перемешайте реакцию путем вортекса и инкубируйте на льду в течение 5 минут до образования мутной массы. Вращайте на максимальной скорости в центрифуге в течение 10 минут, чтобы собрать белую гранулу на дне пробирки. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу 0,5 мл холодного 70% этанола, чтобы удалить остатки соли. Удалите этанол после стирки. Дайте гранулам высохнуть на воздухе при комнатной температуре в течение 15 минут. Ресуспендировать гранулу в воде, не содержащей нуклеаз, в 2-5 раз больше исходного объема реакции. Хранить при температуре -20 °C или -70 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулу дцРНК не следует чрезмерно сушить, так как это может затруднить ее полную ресуспендацию. Для обеспечения достаточной ресуспензии необходимо минимум 2 объема.
7. Проверка количества и качества дцРНК: Разведите дцРНК в воде, не содержащей нуклеаз, в соотношении от 1:100 до 1:300. Определяют концентрацию дцРНК с помощью микрообъемного спектрофотометра (Table of Materials) в соответствии с инструкцией производителя. Чтобы количественно определить дцРНК, умножьте концентрацию на объем. Для оценки качества дцРНК используют электрофорез в агарозном геле. Приготовьте 1% агарозный гель в 1x TAE и разбавьте дцРНК в соотношении 1:50 водой, не содержащей нуклеаз. Используйте 5 мкл разведенной дцРНК на линию и окрашивайте гель в 0,5 мг/мл бромида этидия в течение не менее 15 минут для визуализации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: дцРНК мигрирует медленнее, чем дцДНК.

4. Получение наночастиц хитозана/дцРНК

1. При комнатной температуре сделайте 100 мМ ацетата натрия (0,1 М NaC₂H₃O₂ и 0,1 М уксусной кислоты, pH 4,5 в деионизированной воде) и 100 мМ сульфата натрия (100 мМ Na₂SO₄ в деионизированной воде).
2. Растворить коммерчески проданный хитозан (из панцирей креветок, ≥75% деацетилированный; Таблица материалов) в 100 мМ буфере из ацетата натрия для получения 0,02% (мас./об.) раствора хитозана.
3. Растворите 20 мкг дцРНК в 50 мкл воды, не содержащей нуклеаз, и добавьте ее к 50 мкл буфера из 100 мМ сульфата натрия, чтобы получить 100 мкл раствора дцРНК.
4. Добавьте 100 мкл раствора хитозана к 100 мкл раствора дцРНК. Одновременно готовят контроль, добавляя 100 мкл раствора хитозана к 100 мкл 50 мМ сульфата натрия. Перемешайте и нагрейте смеси при температуре 55 °C в течение 1 минуты.
5. Немедленно окуните смесь в вихрь с помощью высокоскоростного вихря в течение 30 с, чтобы обеспечить образование наночастиц.
6. Центрифугируйте смесь при 13 000 х г при комнатной температуре в течение 10 минут до получения белой гранулы. Перенесите надосадочную жидкость в свежую пробирку объемом 1,5 мл. Дайте гранулам высохнуть на воздухе при комнатной температуре в течение 10 минут.
7. Определяют концентрацию дцРНК в надосадочной жидкости с помощью микрообъемного спектрофотометра (Таблица материалов). Используйте надосадочную жидкость из контроля в качестве заготовки. Умножьте концентрацию на объем, чтобы рассчитать общее количество дцРНК, оставшееся в надосадочной жидкости. Рассчитайте процентное содержание дцРНК, инкапсулированной в наночастицах, на оставшееся в надосадочной жидкости количество, деленное на начальное количество дцРНК.
   Примечание: Несмотря на то, что наночастицы можно хранить при температуре от 4 до 37 °C в течение не менее 15 дней перед использованием¹⁴, рекомендуется использовать наночастицы как можно скорее.

5. Кормление личинок тутового шелкопряда наночастицами хитозана/дцРНК

1. Выберите только что линявших личинок шелкопряда^5-го возраста (т.е. 1-й день^5-го возраста) того же размера для эксперимента по кормлению. Поместите личинки по отдельности в каждую лунку 6-луночного планшета перед закрытием крышки и голодайте в течение 24 часов.
2. Свежие листья шелковицы промойте деионизированной водой и обсушите чистой кухонной бумагой. Листья шелковицы должны быть сухими без капель воды. Разрежьте на 1 см х 1 см листовые диски шелковицы.
3. Перед использованием растворите наночастицы хитозана/дцРНК в воде без нуклеаз в концентрации 500 нг/мкл. Разбавьте контрольные наночастицы хитозана (полученные в 4.4) тем же объемом воды, не содержащей нуклеаз. Приготовьте голую дцРНК до 500 нг/мкл в воде, не содержащей нуклеаз.
4. Используйте наночастицы хитозана/дцРНК для эксперимента по нокдауну РНК-интерференции, контрольные наночастицы хитозана в качестве пустого/отрицательного контроля. Используйте голую дцРНК для сравнения различий с наночастицами хитозана/дцРНК.
5. Покрытие 10 мкл наночастиц хитозана/дцРНК, хитозана и голой дцРНК на поверхности каждого диска листа соответственно. Раствор наночастиц и раствор дцРНК высушить на воздухе на листовых дисках при комнатной температуре в течение 5 минут.
6. Кормите каждую личинку одним листовым диском, покрытым наночастицами или дцРНК, в день. Подарите личинкам листовые диски, покрытые наночастицами или дцРНК, непрерывно в течение 5 дней. Свежие листья шелковицы могут быть предоставлены после того, как покрытый покрытием диск листьев будет полностью съеден личинками каждый день.
7. На 6 день обезболить личинок на льду до тех пор, пока они не перестанут двигаться, и препарировать личинок для взятия пробы. Отрежьте грудную клетку ножницами на чистой чашке Петри. Вытащите среднюю кишку пинцетом. Удалите содержимое из средней кишки и промойте среднюю кишку в другой чашке Петри, наполненной водой, не содержащей нуклеаз. Храните среднюю кишку в пробирке объемом 1,5 мл и держите при температуре -70 °C.

6. Подтверждение сайленсинга генов

1. Выполните количественную ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) для расчета количественного определения относительного транскрипта. Для каждой биологической реплики требуется не менее трех биологических реплик и трех технических реплик. Для нормализации относительного транскрипта рекомендуется использовать как минимум два референсных гена. Тестируется ген Bombyx Toll9-2 (BmToll9-2). Оцените эффективность подавления экспрессии генов путем сравнения среднего значения относительного транскрипта с контрольной группой и переведите его в проценты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Условия амплификации qRT-PCR, информацию о праймерах и расчет относительного транскрипта можно найти в нашей недавней публикации²⁰.
2. Проанализируйте фенотип РНК-интерференции для оценки эффекта сайленсинга генов. Наблюдайте за размерами личинок и коконов. Ежедневно делайте фотографии, чтобы запечатлеть свои выступления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: РНК-интерференция может влиять на морфологию, метаморфоз, физиологию и поведение. Наблюдение за фенотипами, связанными с РНК-интерференцией, зависит от целевых генов.

Результаты

Для оценки эффективности РНК-интерференции для анализа был выбран иммунный ген, нацеленный на BmToll9-2 . Ген BmToll9-2 хорошо охарактеризован в лаборатории, а подавление экспрессии генов путем инъекции дцРНК приводит к получению более легких и мелких личинок в наше...

Обсуждение

Для наблюдения за фенотипом РНК-интерференции важен правильный этап, в зависимости от целевых генов. Наши предварительные результаты показали, что Toll9-2 участвует в росте шелкопряда. Размер и масса личинок тутового шелкопряда быстро увеличиваются в^5-м возра...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tube	Sangon	F601620	for dsRNA or nanoparticles reaction
10 μl pipette	Eppendorf	P13473G	to aspirate or resuspend liquid
100 μl pipette	Eppendorf	Q12115G	to aspirate or resuspend liquid
2.5 μl pipette	Eppendorf	P20777G	to aspirate or resuspend liquid
20 μl pipette	Eppendorf	H19229E	to aspirate or resuspend liquid
200 μl pipette	Eppendorf	H20588E	to aspirate or resuspend liquid
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Costar	3516	for silkworm rearing individually
Acetic acid	Aladdin	A116165	to make TAE
Agarose M	BBI Life Sciences	A610013	for agarose gel electrophosis
Analytical balance	Sartorius	BSA224S	to weight ingredients
Centrifuge	Sartorius	Centrisart A-14C	to centrifuge to form dsRNA or nanoparticles
Chitosan	Sigma-Aldrich	C3646	to combine with dsRNA for preparation of nanoparticles
EDTA	Sangon	A500895	to make TAE
Ethanol	Aladdin	E130059	to make TAE, or for dsRNA precipitation
Freezer	Siemens	iQ300	to store dsRNA or nanoparticles
GoTaq Green Master Mix	Promega	M712	for PCR reaction
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6002	for qRT-PCR reaction
Isopropanol	Aladdin	I112011	for dsRNA precipitation
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher	One	to determine the concentration of dsRNA
ph meter	Sartorius	PB-10	to prepare buffers
SanPrep Column PCR Product Purification Kit	Sangon	B518141	for PCR product purification
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889	to make 100 mM sodium acetate buffer
Sodium sulfate	Sigma-Aldrich	239313	to make 100 mM sodium sulfate buffer
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	for dsRNA synthesis
ThermoMixer	Eppendorf	C	for dsRNA generation or nanoparticles heating
Tris	Sangon	A501492	to make TAE
Vortex	IKA	Vortex 3	to prepare chitosan/dsRNA nanoparticles