قبل البدء في عزل جنين الفئران ، نظف المنطقة جيدا باستخدام 70٪ إيثانول. تأكد من غسل جميع أدوات التشريح وتعقيمها. احصل على خمسة ملليلتر من DMEM المعقم الذي يحتوي على 10٪ FBS ، و 20 ملليلتر من DPBS وضعه على الثلج.
بجانب إجراء عزل الجنين ، باستخدام مجهر ستيريو مع مرحلة ضوئية وكاميرا مرسلة ، ضع السد الحامل الرحيم بشكل صحيح على ظهره وعقم المنطقة القريبة من فتحة المهبل بالإيثانول. باستخدام مقص التشريح والملاقط ، ارفع طية الجلد بالقرب من فتحة المهبل وقم بعمل قطع صغير على شكل حرف V يكشف ببطء عن رحم السد الحامل. ثم قم بتشريح قرن الرحم للسد عن طريق إمساك أحد طرفيه بملاقط وقطعه.
التأكد من إزالة عنق الرحم. ضع قرن الرحم في طبق بتري 10 سم يحتوي على DPBS على الجليد. باستخدام مقص التشريح والملاقط ، قم بإزالة عضلة الرحم على طول مواقع الزرع وقطع كل موقع زرع أو لآلئ تحتوي على التورمات العشرية بالداخل.
ضعه في DPBS الطازج في طبق بتري ستة سنتيمترات على الجليد. خذ موقع زرع واحد. ضعه في طبق بتري جديد يبلغ طوله ستة سنتيمترات أعلى مرحلة المجهر الاستريو ، وأضف 500 ميكرولتر من DPBS إليه.
اضبط تركيز المجهر ومصدر الضوء. اضغط باستمرار على موقع الزرع بمجموعة واحدة من الملقط في يد واحدة ، وباليد الأخرى أدخل ببطء زوجا آخر من الملقط في نهاية موقع الزرع المقطوع من قرن الرحم ، وكشف تدريجيا عن التورم المتساقط. للكشف عن الجنين ، أمسك الطرف المضاد للمحاكمة للتورم العشري المعزول بزوج واحد من الملقط ومع الزوج الآخر ، قم ببطء بعمل قطع أفقي حوالي ربع حجم التورم العشري من الطرف الخاطئ.
الآن مع كلا الملقط ، ادفع ببطء من الطرف المضاد للتورم الخاطئ للتورم اللبني حتى يخرج الجنين من الطرف الخاطئ المقطوع حديثا. بمجرد الكشف عن الجنين ، تابع إزالة أي أنسجة جنينية إضافية متصلة. إذا لم يخرج كيس الأديم الباطن الجداري ومخروط المشيمة الخارجي تلقائيا من الجنين ، فاستخدم زوجا من الملقط لإزالتهما مع أي دم أم مرتبط به.
ثم أثناء الضغط على الجنين بزوج واحد من الملقط ، قشر ببطء كيس الصفار الحشوي من الجنين باستخدام زوج آخر من الملقط. حدد موقع كيس الأديم الباطن الجداري والمخروط الظاهر. باستخدام ماصة AP 20 ، انقل كيس الصفار بما لا يزيد عن 10 ميكرولترات من DPBS من الطبق إلى أنبوب PCR ثمانية شرائط على الجليد.
التقط صورا ميدانية مشرقة للأجنة المعزولة حديثا للتأكد من أن مرحلة زملاء القمامة متشابهة. باستخدام ماصة P200 ، انقل الجنين ببطء مع 50 ميكرولترا من DMEM تحتوي على 10٪ FBS إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر يتم الاحتفاظ به على الجليد. كرر الشيء نفسه لجميع التورم العشري ، باستخدام أدوات نظيفة ومواد بلاستيكية جديدة لكل عزلة.
