تفكك الخلايا لأجنة الفئران المعزولة لتسلسل الخلية الواحدة

المضي قدما في إجراء تفكك الخلايا لأجنة الفئران المعزولة بمجرد تأكيد الأنماط الجينية. باستخدام ماصة P200 ، أضف 50 ميكرولترا من DMEM مع 10٪ FBS إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر. بعد تجميع الأجنة التي لها نفس النمط الجيني في الأنبوب الجديد ، ضعها على الجليد.

اسمح للأجنة المجمعة بالاستقرار في قاع الأنبوب ، ثم اغسل الأجنة باستخدام 50 ميكرولترا من DPBS وانتظر حتى تستقر قبل إزالة أكبر قدر ممكن من DPBS دون إزالة الأجنة. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من التربسين إلى الأجنة المجمعة واحتضانها عند 37 درجة مئوية في كتلة حرارية لمدة خمس دقائق. حرك الأنبوب سعة 1.5 ملليلتر برفق كل 30 ثانية لمساعدة الخلايا على الانفصال.

بعد خمس دقائق ، قم بتحييد التربسين ب 300 ميكرولتر من DMEM تحتوي على 10٪ FBS. أجهزة الطرد المركزي الأجنة في 100 غرام لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الحبيبات الصغيرة التي تم الحصول عليها في 40 ميكرولترا من DMEM مع 10٪ FBS وضع الأنبوب على الثلج.

امزج خمسة ميكرولترات من تعليق الخلية مع خمسة ميكرولترات من التريبان الأزرق في أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر ، وقم بامتصاص الخليط لأعلى ولأسفل جيدا. انقل الخليط إلى شريحة لتحديد رقم الخلية وصلاحيتها باستخدام عداد خلية آلي. أخيرا ، انتقل إلى تقسيم خلية واحدة باستخدام شريحة microfluidic ، باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.