이 방법은 복잡한 견본 및 박테리오파지 기지를 둔 진단 및 치료에서 박테리오파지의 열거와 관련있는 바이러스학 및 미생물학 필드에 있는 중요한 문제점을 대답하는 것을 도울 수 있었습니다. 이 기술의 주요 장점은 파지 디스플레이 바이오패닝 실험에서 많은 수의 샘플을 시간 효율적이고 정확한 정량화를 가능하게 한다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 라시미 모한티와 제 실험실대학원생 인 Jasmim Leal이 될 것입니다.
프라이머를 설계하고 재고 농도를 생성한 후, 마이크로리터 당 0.1 마이크로그램의 농도로 참조 T7 파지 DNA를 얻을 수 있습니다. 초순수수를 사용하여 마이크로리터 당 100만 펨토그램에서 0.2 밀리리터 PCR 튜브의 마이크로리터 당 1펨토그램에 이르는 이 DNA를 10배 연속 희석시킵니다. 각 농도의 20 마이크로리터를 준비하여 파이펫 팁을 변경하고 희석의 각 단계 사이에 튜브를 소용돌이치게 하십시오.
그런 다음 마이크로리터 당 펨토그램에서 마이크로리터 당 게놈 사본으로 T7 파지 참조 DNA 농도를 변환합니다. 첫째, 시료 T7 파지 클론의 파이펫 200 마이크로리터는 원하는 10개의 샘플 각각에 대해 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 복제한다. 각 튜브에 DNase 의 마이크로리터 2개를 추가합니다.
튜브를 캡하고 가열 된 건조 목욕에서 10 분 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 그런 다음 가열 된 건조 목욕에서 15 분 동안 섭씨 100도에서 배양하십시오. 10초 동안 18, 534배 g에서 열 처리 파지를 함유한 튜브원심분리기.
원심 분리튜브를 터치 활성화 모드로 설정된 소용돌이 믹서에 10초 동안 놓아 파지를 섞습니다. 10초 동안 18, 534회 g로 다시 회전합니다. 그 후, 실온으로 냉각하기 위해 실험실 벤치에 샘플을 약 1 시간 남겨 둡니다.
qPCR 프리믹스를 알 수 없는 농도의 10개의 바이오팬드 파지 샘플과 트리플리케이트의 표준 농도 7개 시료에 대해 준비한다. qPCR 마스터 믹스 255마이크로리터, 프라이머 51마이크로리터 및 102마이크로리터의 물을 포함하는 51개의 샘플에 대한 프리믹스가 생성되었습니다. 준비된 PCR의 8마이크로리터를 96웰 qPCR 플레이트의 51개의 웰에 혼합합니다.
다음으로 각 우물에 열 처리 된 T7 파지 샘플 2 개를 추가하여 qPCR 프리믹스의 표면 아래에 분배합니다. 접착제 필름을 사용하여 접시를 밀봉하십시오. 알루미늄 호일에 플레이트를 감싸서 형광 사진 표백을 최소화한 다음 qPCR 장비에서 플레이트를 실행합니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 사이클링 조건을 설정하고 곡선 설정을 녹입니다. qPCR을 실행하면 증폭 플롯, 용융 곡선 플롯 및 다중 구성 요소 플롯을 원시 데이터에서 분석합니다. 증폭 플롯은 각 샘플의 PCR 증폭이 성공여부를 나타냅니다.
다성분 플롯은 증폭 주기 전반에 걸쳐 형광 신호의 증폭 및 붕괴를 나타낸다. 용융 곡선 플롯은 프라이머의 특이성을 검증하는 데 사용되지만 각 PCR 제품에는 고유한 용융 온도가 하나 있기 때문에. 표준 곡선은 참조 DNA에서 생성됩니다.
여기서 증폭 효율은 qPCR 연구에서 92.4%의 대표적인 데이터로 계산된 다음 마이크로리터당 10~1,000만 개의 게놈 사본의 테스트 범위에서 이중 층 플라크 분석에 의해 정량화된 동일한 파지에 비교된다. 여기에서 볼 수 있듯이 qPCR 수량의 파지 수는 플라크 분석보다 높습니다. 분산계수에 의해 표현되는 qPCR 방법의 반복성은 이 절차를 시도하는 동안 2.85에서 27.2%에 이르는 값을 갖는 것으로 보이며, 큐PCR의 개발 및 사용에 대한 많은 고려 사항이 있다는 것을 기억하는 것이 중요하며, 신중한 처리 및 시료 준비 및 관련 장비의 교정을 포함하여 파지를 정확하게 정량화하는 것이 중요합니다.
이 방법에 따라, 다른 기술은 복잡한 환경 샘플에서 생체 생체 파닝, 파지 라이브러리 DNA 제제 및 차세대 염기 검출에 포함된 다양한 응용 분야에서 파지 입자를 열거하기 위해 수행될 수 있다. 파지는 실험실에서 생물학적 위험으로 간주되며 장갑과 실험실 코트를 포함한 개인 보호 장비와 같은 예방 조치는 절차를 수행하는 동안 항상 착용해야합니다.
