خط الخلية O9-1 هو أداة مفيدة جدا لدراسة الخلايا قمة العصبية في المختبر. لديها إمكانات كبيرة للاستخدام في مجموعة واسعة من التطبيقات في استخدام مختلف البحوث. O9-1 الخلايا لها مزايا واضحة، مثل سهولة الوصول، والحصول بسرعة على أعداد كافية من الخلايا للتجارب، مما يجعلها طريقة قوية مجانية للدراسات في المختبر من الخلايا قمة العصبية.
للبدء، إعداد الوسائط القاعدية لثقافة الخلية O9-1، وفقاً لبروتوكول النص. ثم، تصفية الوسائط القاعدية، والتفاف عليه في احباط لحمايته من الضوء. بعد ذلك، قم بجمع الوسائط القاعدية المشروطة من خلايا STO المنشطة وفقًا لبروتوكول النص.
أولاً، إذابة aliquot من مصفوفة غشاء الطابق السفلي على الجليد لمدة ساعتين. ثم، وتمييع مصفوفة غشاء الطابق السفلي مع DMEM معقم مصفاة مع 10٪ FBS إلى تركيز النهائي من 0.5mg /مل. معطف لوحة مع مصفوفة غشاء الطابق السفلي في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
ثم، pirate مصفوفة غشاء الطابق السفلي في حين إمالة لوحة. جففي الأطباق عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. عند إضافة مصفوفة غشاء الطابق السفلي إلى اللوحة ، تأكد من أن الحل غطى البئر بالتساوي للحفاظ على خصائص الخلية وتجنب الاختلاف غير الضروري بين التجارب.
استرداد الخلايا O9-1 عن طريق وضع قارورة كرية في 37 درجة مئوية حمام الماء. دوامة ببطء القارورة حتى يتحول المحلول تماما إلى سائل. بعد ذلك، نقل حل الخلية من قارورة التبريد إلى أنبوب الطرد المركزي 15ml.
إضافة خمسة وحدات تخزين DMEM مع 10٪ FBS إلى أنبوب لإعادة تعليق الخلايا. الطرد المركزي الخلايا لمدة ثلاث دقائق في 180 Gs.Then، يتبخر supernatent، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه. المقبل, إعادة تعليق بيليه في وسائل الإعلام القاعدية مكيفة تكمل مع LIF وBFGF.
بذور الخلايا في لوحة ستة بئر، وتهيج لوحة لبذات الخلايا بالتساوي. عند تهيج لوحة، القيام بذلك أفقيا وعموديا، كما دوامة لوحة سوف يسبب الخلايا للتركيز نحو المركز. وتسمح لتلك الخلايا أن نعلق وتنمو في حاضنة ثقافة الخلية القياسية بين عشية وضحاها.
تأكد من إرفاق الخلايا قبل تغيير الوسائط. عندما تصل الخلايا O9-1 إلى 80٪التقاء، ذوبان مصفوفة غشاء الطابق السفلي وإعداد لوحة مصفوفة غشاء الطابق السفلي المغلفة كما هو موضح سابقا. ثم إضافة وسائل الإعلام القاعدية تكملها LIF وBFGF إلى مصفوفة الغشاء.
شطف بلطف الآبار مع 2ml من DPBS مرتين. ثم، افصل الخلايا مع 1ml من 0.05٪تريبسين EDTA في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. تحييد التربسين مع كمية مساوية من DMEM مع 10٪ FBS عن طريق الأنابيب مرارا وتكرارا السائل على سطح كامل من البئر.
ثم، نقل حل الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي. وطاردة مركزية لمدة ثلاث دقائق في 180 Gs.Aspirate supernatent دون إزعاج بيليه من الخلايا. المقبل, resuspend بيليه الخلية عن طريق pippetting بلطف مشروط وسائل الإعلام القاعدية تكملها LIF و BFGF.
بذور الخلايا إلى لوحة المغلفة كما هو موضح سابقا. ثم، السماح للخلايا إرفاق وتنمو في حاضنة ثقافة الخلية القياسية. أولاً، إعداد الوسائط تجميد 2X وفقاً للبروتوكول النص.
ثم، تصفية تعقيم وسائل الإعلام. شطف جدران لوحة مع DPBS مرتين، pipetting بلطف لتجنب فقدان الخلايا. بعد ذلك فصل الخلايا مع 0.05٪ تريبسين EDTA في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق.
تحييد التربسين مع كمية متساوية من 10٪ FBS و DMEM. نقل محتويات لوحة إلى أنبوب الطرد المركزي، والطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق في 180 Gs.Then، وpirate supernatent وإضافة 2ml من برنامج تلفزيوني لإعادة تعليق بيليه. الطرد المركزي حل الخلية مرة أخرى وpiratessnt.
ضبط كمية الوسائط القاعدية في الأنبوب حسب الحاجة، وإضافة كمية مساوية للوسائط تجميد 2X. بعد ذلك، نقل الخلايا إلى قارورة التبريد المسماة. ضع قارورة التبريد داخل صندوق البوليسترين مع غطاء لتحقيق معدل تبريد بطيء عند 80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل.
لتنفيذ ضربة قاضية SIRNA في الخلايا O9-1، استرداد والبذور الخلايا. تخفيف الليبوزومات في حجم مناسب من وسائل الإعلام خالية من المصل. ثم، تمييع السيرنا في وسائل الإعلام خالية من المصل وفقا لبروتوكول النص.
بعد ذلك، أضف السيرنا المخفف إلى الليبوزومات المخففة، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. اخلطي المحلّل عن طريق التنمّر، وحضنّي لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. المقبل, إضافة حجم مناسب من مركب الدهون SIRNA إلى الخلايا.
ثم، احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في حاضنة ثقافة الخلية القياسية. يمكن لخلايا O9-1 أن تتمايز إلى أنواع خلايا مختلفة في ظل ظروف ثقافة التمايز الخاصة. لتمييز الخلايا O9-1 في عمليات تجميل العظام، قم بإعداد وسائل التمايز العظمية وفقًا لبروتوكول النص.
وأخيرا، الكشف عن osteocalcin علامة العظام في عمليات تجميل العظام المتمايزة عن طريق التلطيخ المناعي. للتمييز الخلايا O9-1 في خلايا العضلات الملساء, ثقافة لهم في إطار وسائل الإعلام التمايز وفقا لبروتوكول النص, وتقييم التمايز بواسطة العضلات الملساء actin الملطخة المناعية. في هذا البروتوكول، تم تنفيذ كل من ضرب وضرب التجربة لدراسة فقدان ياب من وظيفة في الخلايا O9-1.
في ظل ظروف تمايز الخلايا العضلية الملساء، أعطى معظم أنواع البرية O9-1 الخلايا التي أدت إلى العضلات على نحو سلس actin خلايا العضلات الملساء الإيجابية. ياب الخلايا الفارغة ولكن عموما فشلت في التفريق في خلايا العضلات الملساء الإيجابية SMA. وهذا يشير إلى أن ياب يلعب دورا حاسما في تمايز خلايا القمم العصبية في خلايا العضلات الملساء.
أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر التعامل مع خط الخلية O9-1 بلطف وعناية خلال العملية بأكملها. تأكد من تخفيف واستخدام مصفوفة الغشاء القاعدي بشكل صحيح، واستخدام 0.05٪ التربسين لتفكك الخلايا. لا ننسى أنه أثناء التحضير لثقافة الخلية O9-1، يمكن أن يكون العمل مع الميتوميسين ج خطرة للغاية، وينبغي دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معطف المختبر والقفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
