A linha celular O9-1 é uma ferramenta muito útil para estudar células de crista neural in vitro. Tem um grande potencial para uso em uma ampla gama de aplicações em vários usos de pesquisa. As células O9-1 têm vantagens óbvias, como fácil acesso, e rapidamente obtenção de números celulares suficientes para experimentos, tornando-se um método poderoso de cortesia a estudos in vitro de células de crista neural.
Para começar, prepare a mídia basal para a cultura celular O9-1, de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, filtre a mídia basal e enrole-a em papel alumínio para protegê-la da luz. Depois disso, colete mídia basal condicionada de células STO ativadas de acordo com o protocolo de texto.
Primeiro, descongele uma alíquota da matriz de membrana do porão no gelo por duas horas. Em seguida, diluir a matriz de membrana do porão com DMEM esterilizado filtrado com 10% de FBS a uma concentração final de 0,5mg/ml. Cubra a placa com a matriz de membrana do porão em temperatura ambiente por uma hora.
Em seguida, aspire a matriz de membrana do porão enquanto inclina a placa. Seque as placas a 30 graus Celsius por 30 minutos. Ao adicionar a matriz de membrana do porão à placa, certifique-se de que a solução cobriu o poço uniformemente para manter as características celulares e evitar variações desnecessárias entre os experimentos.
Recupere as células O9-1 colocando um crio-frasco em um banho de água de 37 graus Celsius. Gire lentamente o frasco até que a solução se transforme completamente em líquido. Depois disso, transfira a solução celular do crio-frasco para um tubo de centrífuga de 15ml.
Adicione cinco volumes de DMEM com 10% de FBS ao tubo para suspender as células. Centrifugar as células por três minutos a 180 Gs.Então, aspire o supernagente, tomando cuidado para não perturbar a pelota. Em seguida, suspenda a pelota em mídia basal condicionada complementada com LIF e BFGF.
Semear as células em uma placa de seis poços, e agitar a placa para semear as células uniformemente. Ao agitar a placa, faça-o horizontal e verticalmente, pois girar a placa fará com que as células se concentrem em direção ao centro. E permitir que essas células se conectem e cresçam em uma incubadora de cultura celular padrão durante a noite.
Certifique-se de que as células estão anexadas antes de alterar a mídia. Quando as células O9-1 atingirem 80% de confluência, descongele a matriz de membrana do porão e prepare uma placa revestida de matriz de membrana do porão, como descrito anteriormente. Em seguida, adicione a mídia basal complementada com LIF e BFGF à matriz de membrana.
Enxágue suavemente os poços com 2ml de DPBS duas vezes. Em seguida, dissociar as células com 1ml de 0,05% de trippsina EDTA a 37 graus Celsius por três minutos. Neutralizar a trippsina com uma quantidade igual de DMEM com 10% de FBS, esbofetando repetidamente o líquido sobre toda a superfície do poço.
Em seguida, transfira a solução celular para um tubo de centrífuga. E centrífuga por três minutos a 180 Gs.Aspire o supernatent sem perturbar a pelota das células. Em seguida, resuspenque a pelota celular fornecendo suavemente mídia basal condicionada complementada com LIF e BFGF.
Semear as células para a placa revestida como descrito anteriormente. Então, permita que as células se conectem e cresçam em uma incubadora de cultura celular padrão. Primeiro, prepare a mídia de congelamento 2X de acordo com o protocolo de texto.
Em seguida, esterilize a mídia. Enxágüe as paredes da placa com DPBS duas vezes, esbotoando suavemente para evitar a perda de células. Em seguida, dissociar as células com 0,05% de trippsina EDTA a 37 graus Celsius por três minutos.
Neutralizar a trippsina com uma quantidade igual de 10% FBS e DMEM. Transfira o conteúdo da placa para um tubo de centrífuga e centrífuga por três minutos a 180 Gs.Em seguida, aspire o supernante e adicione 2ml de PBS para resuspensar a pelota. Centrifugar a solução celular mais uma vez e aspirar o supernatent.
Ajuste a quantidade de mídia basal no tubo conforme necessário e adicione uma quantidade igual de mídia de congelamento de 2X. Em seguida, transfira as células para os frascos de criogenia rotulados. Coloque os frascos crionitos dentro de uma caixa de poliestireno com uma tampa para obter uma taxa de resfriamento lenta a 80 graus Celsius por pelo menos 24 horas.
Para realizar o knockdown SIRNA em células O9-1, recupere e semee as células. Lipossomos diluídos em um volume apropriado de mídia sem soro. Em seguida, dilui o SIRNA em mídia livre de soro de acordo com o protocolo de texto.
Depois disso, adicione o SIRNA diluído aos lipossomos diluídos, de acordo com as instruções do fabricante. Misture a solução por pipetação e incubar por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione um volume apropriado de complexo lipídedo SIRNA às células.
Em seguida, incubar as células por 24 horas em uma incubadora de cultura celular padrão. As células O9-1 podem se diferenciar em diferentes tipos de células em condições específicas de cultura de diferenciação. Para diferenciar as células O9-1 em osteoplastos, prepare os meios de diferenciação osteogênica de acordo com o protocolo de texto.
Por fim, detecte o osteocalcina marcador de osteoplastias em osteoplastos diferenciados por uma coloração imuno. Para diferenciar as células O9-1 em células musculares lisas, cultuá-las sob meios de diferenciação de acordo com o protocolo de texto e avaliar a diferenciação poroxidação imuno de actina muscular suave. Neste protocolo, ambos nocauteam e derrubam experimentos para estudar a perda de função yap em células O9-1 foram realizados.
Sob condições de diferenciação de células musculares lisas, a maioria das células selvagens do tipo O9-1 deu origem a células musculares lisas. As células nulas yap, no entanto, geralmente não conseguiram se diferenciar em células musculares lisas positivas da SMA. Isso indica que Yap desempenha um papel crítico na diferenciação das células da crista neural em células musculares lisas.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear a linha celular O9-1 suavemente e cuidadosamente durante todo o processo. Certifique-se de diluir e usar a matriz de membrana basal corretamente, e use 0,05% de trippsina para dissociação celular. Não se esqueça que durante a preparação para a cultura celular O9-1, trabalhar com mitomicina c pode ser extremamente perigoso, e precauções como usar um jaleco e luvas devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
