يسهل البروتوكول تشغيل ثقافة المواد العضوية الدماغية ويساعد على تعزيز تطبيق المواد العضوية في الدماغ. يمكن رؤية المرحلة المبكرة من العضوية بالعين المجردة باستخدام مصباح ضوء ناعم جانبي مناسب للعديد من العمليات. طرق التغيير المتوسطة المحسنة وعمليات نقل المواد العضوية مفيدة أيضا لأنواع أخرى من الثقافات العضوية وتصميم آلات الثقافات الأوتوماتيكية.
للبدء ، قم بزراعة iPSCs بوسط mTeSR1 في طبق بتري مغطى ب 35 ملم وقم بتغيير الوسط كل يوم. يجب ألا تتجاوز كثافة نمو iPSC 75٪ ، ثم قم بإخراج وسط mTeSR1 من iPSCs وغسله مرتين بملليمتر واحد من PBS. بعد سحب PBS ، أضف 300 ميكرولتر من محلول انفصال الخلايا لهضم iPSCs إلى خلايا مفردة لمدة ثلاث إلى أربع دقائق عند 37 درجة مئوية.
في وقت لاحق ، أعد تعليق الخلايا في مليمترين من وسط تكوين EB وطرد مركزي للعينة لمدة خمس دقائق عند 300 مرة جم. عالج صفيحة البئر المتخصصة المكونة من 24 بئرا ب 500 ميكرولتر لكل بئر من محلول الشطف المضاد للالتصاق لمدة خمس دقائق. الآن ، أعد تعليق الخلايا في وسط تكوين EB الذي يحتوي على مثبط Rho kinase Y27632.
بعد إزالة محلول الشطف المضاد للالتصاق ، اشطف كل بئر بملليلترين من وسط تكوين EB. بعد ذلك ، أضف الخلايا إلى لوحات البئر المتخصصة البالغ عددها 24 لوحة بكثافة ثلاثة أضعاف 10 إلى الخلايا السادسة لكل بئر وقم بالطرد المركزي للصفيحة عند 100 مرة g لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. توزيع الخلايا بشكل موحد في كل غرفة في الجزء السفلي من اللوحة.
احتضان العينات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. إذا لم يتم استخدام الطرد المركزي في الخطوة السابقة ، فقم باحتضان لمدة 36 ساعة والحفاظ على ثبات العينة. استخدم لوحة أكريليك شفافة بسماكة 0.3 إلى 0.5 سم بحجم ورق A5 والصق وسادات بيضاء على الجزء الأمامي والخلفي من لوحة الأكريليك.
بعد ذلك ، قم بتثبيت صف من مصابيح LED البيضاء على حافة اللوحة بحيث يمكن للأضواء الدخول من جانب لوحة الأكريليك ثم إطلاق النار بالتوازي. الآن ، قم بإعداد لوحة جديدة ذات ستة آبار منخفضة الالتصاق وأضف ملليلترين من وسط تكوين EB إلى كل بئر. بعد إزالة EBs مع الوسط باستخدام 1000 ميكرولتر من طرف ماصة التجويف العريض ، انقل ما يقرب من 100 EBs لكل بئر إلى لوحة الالتصاق الستة المنخفضة البئر.
لاستبدال وسط تكوين EB كل يوم بنفس الحجم من الوسط الطازج ، قم بتحفيز تدفق دوامة عن طريق تدوير الطبق على طول مدار دائري. تتلاقى EBs أو العضوية مع مركز البئر بسبب التدفق الثانوي المتولد من خلال الدوران. استنشاق الوسط القديم عن طريق الأنابيب إلى حافة البئر ببطء.
لا تمتص بشدة ، وإلا ستتم إزالة EBs معا. ثم أضف وسائط جديدة لإعادة تعليق EBs. بالنسبة للحث العصبي ، قم بإعداد لوحة جديدة ذات ستة مواضع منخفضة الالتصاق مع ثلاثة ملليلترات من وسط الحث العصبي لكل بئر.
قم بتشغيل الضوء الناعم الجانبي وأطفئ مصادر الإضاءة الداخلية الأخرى. الآن انقل EBs إلى صفيحة البئر الستة مع وسط تحريض عصبي مضاف باستخدام طرف ماصة فم عريض لامتصاص كل من EBs ووسط الثقافة. ثم ، أمسك الماصة في وضع مستقيم.
سوف تغرق EBs تدريجيا تحت الجاذبية وتتلاقى نحو فم طرف الماصة. عندما يلمس فم طرف الماصة سطح السائل مرة أخرى ، وبسبب التوتر السطحي السائل ، تغرق EBs بسرعة في الوسط. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.
ضع مصفوفة الغشاء في ثلاجة بأربع درجات مئوية لمدة 60 دقيقة حتى تذوب. بعد تشغيل الضوء الناعم الجانبي ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الضوء الموجود أعلى وحدة التحكم واحتفظ بمصفوفة الغشاء على الجليد لمنع التصلب. انقل كمية صغيرة من EBs إلى طبق 60 ملم يحتوي على وسط تمدد طازج لتسهيل إزالة EB واحد. باستخدام طرف ماصة بعرض التجويف يبلغ 200 ميكرولتر، قم بامتصاص EB واحد يحتوي على ما يقرب من 10 ميكرولترات متوسطة في كل مرة، ثم قم بعمل قطرات عن طريق إضافته إلى الجزء السفلي من لوحة البئر الستة.
استخدم خمس قطرات لكل بئر. أضف 15 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء إلى كل قطرة تحتوي على EB. امزج بسرعة وقم بتضمين كرة EB في وسط القطرة.
اسمح للقطرات التي تحتوي على EBs بالتصلب عن طريق وضع صفيحة البئر الستة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم أضف ثلاثة ملليلترات من وسط التمدد إلى كل بئر وقم بتفجير EBs المدمجة في المصفوفة بلطف لتعليقها واحتضانها لمدة ثلاثة أيام. للنضج العضوي ، قم بإزالة الوسط الأصلي بلطف وأضف ثلاثة ملليلتر من وسط النضج إلى كل بئر.
ضع الصفيحة العضوية على شاكر أفقي في حاضنة 37 درجة مئوية واستمر في تدوير الثقافة أفقيا. تغيير وسط النضج الطازج كل يومين إلى ثلاثة أيام. نظرا للجاذبية والكثافة الأعلى نسبيا من الوسط ، ستغرق EBs المعاد تعليقها تدريجيا.
وبالتالي ، يمكن نقل EBs بسهولة. بالمقارنة مع EBs ، تغرق الخلايا الحرة وشظايا الخلايا الميتة ببطء أكبر. وبالتالي يمكن إزالة معظم الخلايا الحرة وشظايا الخلايا الميتة.
عبرت EBs المزروعة في المرحلة المبكرة عن علامة OCT4 التي أشارت إلى تعدد القدرات الجيد. في المرحلة اللاحقة ، تطورت EBs إلى عضويات دماغية ناضجة. كانت المواد العضوية الدماغية الناضجة إيجابية لعلامة الخلايا السلفية القمية PAX6 وعلامة الخلايا العصبية المحددة tubulin J1. تم زراعة iPSCs من الأفراد الأصحاء ومرضى SCA3 لتنمو لتصبح عضويات.
أظهرت ملامح التعبير الجيني للمجموعة العضوية الدماغية الطبيعية ومجموعة SCA3 العضوية الدماغية اختلافات كبيرة في المسارات مثل نقل الناقل العصبي وتكوين المشبك والتنظيم. عند تضمين EB مع مصفوفة الغشاء السفلي ، يجب ألا تكون أوقات التشغيل طويلة جدا لتجنب جفاف EBs. يوصى بالحماية بسرعة.
