Das Protokoll erleichtert den Betrieb der zerebralen Organoidkultur und hilft, die Anwendung von Gehirnorganoiden zu fördern. Das Organoid des früheren Stadiums kann mit bloßem Auge gesehen werden, indem eine seitliche Weichlichtlampe verwendet wird, die für viele Operationen geeignet ist. Die verbesserten Medium-Change-Methoden und Organoid-Transfer-Operationen sind auch für andere Arten von Organoidkulturen und das Design von automatischen Kulturmaschinen hilfreich.
Zu Beginn werden die iPSCs mit mTeSR1-Medium in einer mit Matrigel überzogenen 35-Millimeter-Petrischale kultiviert und das Medium täglich gewechselt. Die iPSC-Wachstumsdichte darf 75% nicht überschreitenDann pipettieren Sie das mTeSR1-Medium aus den iPSCs und waschen es zweimal mit einem Millimeter PBS. Nachdem Sie das PBS herausgepipettiert haben, fügen Sie 300 Mikroliter Zellablösungslösung hinzu, um die iPS-Zellen für drei bis vier Minuten bei 37 Grad Celsius in einzelne Zellen zu verdauen.
Später suspendieren Sie die Zellen in zwei Millimetern EB-Bildungsmedium und zentrifugieren die Probe fünf Minuten lang bei 300 mal g. Behandeln Sie die spezielle 24-Well-Platte fünf Minuten lang mit 500 Mikrolitern Anti-Adherence-Spüllösung pro Well. Resuspendieren Sie nun die Zellen im EB-Bildungsmedium, das den Rho-Kinase-Inhibitor Y27632 enthält.
Nach dem Entfernen der Anti-Adhärenz-Spüllösung spülen Sie jedes gut mit zwei Millilitern EB-Formationsmedium ab. Als nächstes fügen Sie die Zellen zu den spezialisierten 24 Well-Platten mit einer Dichte von drei mal 10 bis zu den sechsten Zellen pro Well hinzu und zentrifugieren Sie die Platte bei 100 mal g für zwei Minuten bei Raumtemperatur. Verteilen Sie die Zellen gleichmäßig in jeder Kammer am Boden der Platte.
Inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 24 Stunden. Wenn im vorherigen Schritt keine Zentrifugation verwendet wurde, inkubieren Sie 36 Stunden lang und halten Sie die Probe stabil. Verwenden Sie eine transparente Acrylplatte mit einer Dicke von 0,3 bis 0,5 Zentimetern in der Größe von A5-Papier und kleben Sie weiße Pads auf die Vorder- und Rückseite der Acrylplatte.
Als nächstes installieren Sie eine Reihe von LED-Weißlichtern am Rand der Platte, so dass die Lichter von der Seite der Acrylplatte eintreten und dann parallel herausschießen können. Bereiten Sie nun eine neue Platte mit sechs Bohrlöchern mit niedriger Haftung vor und fügen Sie jedem Bohrloch zwei Milliliter EB-Formationsmedium hinzu. Nachdem Sie die EBs zusammen mit dem Medium mit einer Pipettenspitze mit einer Breite von 1000 Mikrolitern entfernt haben, übertragen Sie etwa 100 EBs pro Bohrloch auf die Platte mit niedriger Adhäsion mit sechs Bohrlöchern.
Um das EB-Formationsmedium jeden Tag durch das gleiche Volumen an frischem Medium zu ersetzen, induzieren Sie einen Drallfluss, indem Sie die Schale entlang einer kreisförmigen Umlaufbahn drehen. Die EBs oder Organoide konvergieren aufgrund der durch Rotation erzeugten Sekundärströmung zum Zentrum des Bohrlochs. Saugen Sie das alte Medium ab, indem Sie langsam zum Rand des Brunnens pfeifen.
Nicht zu stark saugen, sonst werden die EBs zusammen entfernt. Fügen Sie dann neue Medien hinzu, um die EBs wieder anzuhalten. Für die neuronale Induktion bereiten Sie eine neue Platte mit sechs Bohrlöchern niedriger Adhäsion mit drei Millilitern neuronalem Induktionsmedium pro Bohrung vor.
Schalten Sie das seitliche weiche Licht ein und schalten Sie andere Innenlichtquellen aus. Übertragen Sie nun die EBs auf die Sechs-Well-Platte mit zusätzlichem neuronalem Induktionsmedium, indem Sie eine breite Mundpipettenspitze verwenden, um sowohl die EBs als auch das Kulturmedium zu saugen. Halten Sie dann die Pipette aufrecht.
Die EBs sinken allmählich unter der Schwerkraft und konvergieren zur Mündung der Pipettenspitze. Da der Mund der Pipettenspitze die Flüssigkeitsoberfläche wieder berührt und aufgrund der flüssigen Oberflächenspannung sinken die EBs schnell in das Medium ein. Inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 24 Stunden.
Legen Sie die Membranmatrix für 60 Minuten in einen vier Grad Celsius-Kühlschrank, um sich aufzulösen. Nachdem Sie das seitliche weiche Licht eingeschaltet haben, schalten Sie die Lichtquelle auf der Oberseite der Konsole aus und halten Sie die Membranmatrix auf Eis, um eine Erstarrung zu verhindern. Übertragen Sie eine kleine Menge EBs auf eine 60-Millimeter-Schale, die ein frisches Expansionsmedium enthält, um das Entfernen einzelner EBs zu erleichtern. Saugen Sie mit einer 200 Mikroliter breiten Pipettenspitze jedes Mal einen einzelnen EB mit etwa 10 Mikrolitern Medium ab und machen Sie dann Tröpfchen, indem Sie ihn auf den Boden der sechs Bohrlochplatten geben.
Verwenden Sie fünf Tröpfchen pro Well. Fügen Sie 15 Mikroliter der Membranmatrix zu jedem EB enthaltenden Tropfen hinzu. Mischen und betten Sie die EB-Kugel schnell in die Mitte des Tröpfchens ein.
Lassen Sie die Tröpfchen, die EBs enthalten, erstarren, indem Sie die Platte mit sechs Vertiefungen für 30 Minuten in einen 37 Grad Celsius-Inkubator geben. Fügen Sie dann drei Milliliter des Expansionsmediums zu jeder Vertiefung hinzu und blasen Sie die in die Matrix eingebetteten EBs vorsichtig auf, um sie zu suspendieren und drei Tage lang zu inkubieren. Für die organoide Reifung entfernen Sie vorsichtig das ursprüngliche Medium und fügen Sie drei Milliliter Reifungsmedium zu jeder Vertiefung hinzu.
Legen Sie die Organoidplatte auf einen horizontalen Shaker in einem 37 Grad Celsius Inkubator und drehen Sie die Kultur weiter horizontal. Wechseln Sie das frische Reifemedium alle zwei bis drei Tage. Aufgrund der Schwerkraft und der relativ höheren Dichte als das Medium sinken die resuspendierten EBs allmählich ab.
Somit können die EBs bequem übertragen werden. Im Vergleich zu EBs sinken freie Zellen und abgestorbene Zellfragmente langsamer ab. Die meisten freien Zellen und toten Zellfragmente können so entfernt werden.
Die in der Frühphase kultivierten EBs drückten den OCT4-Marker aus, der auf eine gute Pluripotenz hinwies. Im späteren Stadium entwickelten sich die EBs zu reifen zerebralen Organoiden. Die reifen zerebralen Organoide waren positiv für den apikalen Vorläuferzellenmarker PAX6 und den neuronenspezifischen Marker Tubulin J1. Die iPS-Zellen von gesunden Personen und SCA3-Patienten wurden kultiviert, um zu Organoiden zu wachsen.
Die Genexpressionsprofile der normalen zerebralen Organoidgruppe und der SCA3-Gruppe der zerebralen Organoide zeigten signifikante Unterschiede in Signalwegen wie Neurotransmittertransport, Synapsenbildung und Regulation. Bei der Einbettung des EB mit Basalmembranmatrix sollten die Betriebszeiten nicht zu lang sein, um ein Austrocknen der EBs zu vermeiden. Es wird empfohlen, schnell zu schützen.
