הפרוטוקול מקל על פעולתה של תרבית אורגנואידים מוחית ומסייע לקדם את היישום של אורגנואידים במוח. את האורגנואיד בשלב מוקדם יותר ניתן לראות בעין בלתי באמצעות מנורת אור רכה לרוחב הנוחה לפעולות רבות. שיטות שינוי המדיום המשופרות ופעולות העברת האורגנואידים מועילות גם לסוגים אחרים של תרביות אורגנואידים ולתכנון מכונות תרביות אוטומטיות.
כדי להתחיל, תרבית את iPSCs עם mTeSR1 בינוני ב matrigel כיסה 35 מילימטר צלחת פטרי ולשנות את המדיום מדי יום. צפיפות הצמיחה של iPSC לא תעלה על 75% לאחר מכן, פיפטו את מדיום mTeSR1 מה-iPSCs ושטפו אותו פעמיים עם מילימטר אחד של PBS. לאחר פירוק ה-PBS, הוסיפו 300 מיקרוליטרים של תמיסת ניתוק תאים כדי לעכל את ה-iPSCs לתאים בודדים למשך שלוש עד ארבע דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
מאוחר יותר, החייאת התאים בשני מילימטרים של מדיום היווצרות EB וצנטריפוגה של הדגימה במשך חמש דקות ב 300 פעמים גרם. יש לטפל בצלחת המיוחדת של 24 קידוחים עם 500 מיקרוליטרים לכל באר של תמיסת שטיפה נגד הדבקות למשך חמש דקות. כעת, בצעו החייאה של התאים במדיום היווצרות ה-EB המכיל את מעכב ה-Rho kinase Y27632.
לאחר הסרת תמיסת השטיפה נגד הדבקות, יש לשטוף כל באר בשני מיליליטרים של מדיום היווצרות EB. לאחר מכן, מוסיפים את התאים ל-24 לוחות הבאר המיוחדים בצפיפות של שלוש פעמים 10 עד התאים השישיים לכל באר וצנטריפוגות הצלחת ב-100 פעמים גרם למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. מפזרים באופן אחיד את התאים בכל תא בתחתית הצלחת.
הדגירה של הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 24 שעות. אם לא נעשה שימוש בצנטריפוגה בשלב הקודם, דגרו במשך 36 שעות ושמרו על יציבות הדגימה. השתמשו בלוח אקרילי שקוף בעובי של 0.3 עד 0.5 ס"מ בגודל של נייר A5 והדביקו רפידות לבנות בחלק הקדמי והאחורי של הצלחת האקרילית.
לאחר מכן, התקן שורה של נורות LED לבנות על קצה הצלחת, כך שהאורות יוכלו להיכנס מהצד של הלוחית האקרילית ולאחר מכן לירות החוצה במקביל. כעת, הכינו צלחת הידבקות נמוכה חדשה של שש בארות והוסיפו שני מיליליטרים של מדיום היווצרות EB לכל באר. לאחר הסרת ה- EBs יחד עם המדיום באמצעות 1000 מיקרוליטרים רחבים נשאו קצה פיפטה, העבר כ -100 EBs לכל באר לצלחת ההדבקה הנמוכה של ששת הקידוחים.
כדי להחליף את מדיום היווצרות ה-EB מדי יום באותו נפח של מדיום טרי, לגרום לזרימת מערבולת על ידי סיבוב המנה לאורך מסלול מעגלי. ה- EBs או האורגנואידים מתכנסים למרכז הבאר בשל הזרימה המשנית הנוצרת באמצעות סיבוב. שאפו למדיום הישן על ידי צנרת לקצה הבאר באיטיות.
אל תמצוץ חזק מדי, אחרת ה- EBs יוסרו יחד. לאחר מכן, הוסף מדיה טרייה כדי להחיות את ה- EBs. עבור אינדוקציה עצבית, הכינו צלחת חדשה של שישה לוחות הידבקות נמוכים היטב עם שלושה מיליליטרים של מדיום אינדוקציה עצבית לכל באר.
הדליקו את האור הרך לרוחב וכבו מקורות תאורה פנימיים אחרים. כעת העבירו את ה-EBs לצלחת ששת הקידוחים עם תוספת של מדיום אינדוקציה עצבית על ידי שימוש בקצה פיפטה רחב לפה כדי למצוץ גם את ה-EBs וגם את מדיום התרבית. לאחר מכן, החזיקו את הפיפטה זקופה.
ה-EBs ישקעו בהדרגה תחת כוח הכבידה ויתכנסו לעבר פיו של קצה הפיפטה. כאשר הפה של קצה הפיפטה נוגע שוב במשטח הנוזלי, ובשל מתח פני השטח הנוזלי, ה- EBs שוקעים במהירות לתוך המדיום. הדגירה של הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 24 שעות.
מניחים את מטריצת הממברנה במקרר של ארבע מעלות צלזיוס למשך 60 דקות כדי להתמוסס. לאחר הפעלת האור הרך לרוחב, כבו את מקור האור בחלק העליון של הקונסולה ושמרו על מטריצת הממברנה על קרח כדי למנוע התמצקות. העבר כמות קטנה של EBs למנה של 60 מילימטר המכילה מדיום הרחבה טרי כדי להקל על הסרת EB יחיד. באמצעות קצה פיפטה רחב של 200 מיקרוליטרים, מוצצים EB יחיד המכיל כ-10 מיקרוליטרים בינוניים בכל פעם, ולאחר מכן יוצרים טיפות על ידי הוספתו לתחתית צלחת הבאר של ששת הקידוחים.
השתמש בחמש טיפות לכל באר. הוסף 15 מיקרוליטרים של מטריצת הממברנה לכל EB המכיל טיפה. ערבבו והטמיעו במהירות את כדור ה-EB במרכז הטיפה.
אפשרו לטיפות המכילות EBs להתמצק על ידי הצבת צלחת הבאר שש לחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיליליטרים של מדיום ההתפשטות לכל באר ופוצצו בעדינות את ה-EBs המשובצים במטריצה כדי להשעות אותם ולדגום במשך שלושה ימים. להבשלה אורגנואידית, הסר בעדינות את המדיום המקורי והוסף שלושה מיליליטרים של מדיום התבגרות לכל באר.
מניחים את הלוח האורגנואידי על שייקר אופקי באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס וממשיכים לסובב את התרבית אופקית. החליפו את מדיום ההתבגרות הטרי כל יומיים-שלושה. בשל כוח הכבידה והצפיפות הגבוהה יחסית מהתווך, ה-EBs המוחזרים ישקעו בהדרגה.
לפיכך, ניתן להעביר את ה- EBs בנוחות. בהשוואה ל-EBs, תאים חופשיים ושברי תאים מתים שוקעים לאט יותר. לפיכך ניתן להסיר את רוב התאים החופשיים ואת שברי התאים המתים.
ה- EBs שטופחו בשלב המוקדם ביטאו את סמן OCT4 שהצביע על פלוריפוטנטיות טובה. בשלב מאוחר יותר, ה- EBs התפתחו לאורגנואידים מוחיים בוגרים. האורגנואידים המוחיים הבוגרים היו חיוביים עבור תאי אב אפיים סמן PAX6 וסמן ספציפי לנוירון טובולין J1. ה-iPSCs של אנשים בריאים וחולי SCA3 טופחו כדי לגדול לאורגנואידים.
פרופילי ביטוי הגנים של קבוצת האורגנואידים המוחיים הנורמלית וקבוצת האורגנואידים המוחיים SCA3 הראו הבדלים משמעותיים במסלולים כגון הובלת נוירוטרנסמיטר, היווצרות סינפסות וויסות. בעת הטמעת ה- EB עם מטריצת קרום המרתף, זמני הפעולה לא צריכים להיות ארוכים מדי כדי למנוע ייבוש EBs. מומלץ להגן במהירות.
