このプロトコルは、脳オルガノイド培養の操作を容易にし、脳オルガノイドの適用を促進するのに役立つ。初期段階のオルガノイドは、多くの操作に便利な横方向のソフトライトランプを使用して肉眼で見ることができます。改善された培地交換方法とオルガノイド移送操作は、他のタイプのオルガノイド培養および自動培養機の設計にも役立ちます。
開始するために、mTeSR1培地を用いてiPS細胞をマトリゲルで覆われた35ミリメートルのシャーレで培養し、毎日培地を交換した。iPSC増殖密度は75%を超えてはならず、次に、iPSCからmTeSR1培地をピペットで取り出し、1ミリメートルのPBSで2回洗浄する。PBSをピペッティングした後、300マイクロリットルの細胞剥離溶液を加えて、摂氏37度で3〜4分間、iPS細胞を単一細胞に消化する。
その後、細胞を2ミリメートルのEB形成培地に再懸濁し、サンプルを300倍gで5分間遠心分離する。特殊な24ウェルプレートを、1ウェルあたり500マイクロリットルの抗付着リンス溶液で5分間処理します。次に、Rhoキナーゼ阻害剤Y27632を含むEB形成培地に細胞を再懸濁する。
抗付着性リンス液を除去した後、各ウェルを2ミリリットルのEB形成培地でリンスする。次に、特殊な24ウェルプレートに細胞を1ウェルあたり6番目の細胞に対して10の3倍の密度で加え、プレートを100倍gで室温で2分間遠心分離する。プレートの下部にある各チャンバーに細胞を均一に分布させる。
サンプルを摂氏37度および5%二酸化炭素で24時間インキュベートします。前のステップで遠心分離を使用しなかった場合は、36時間インキュベートし、サンプルを安定に保ちます。A5用紙サイズの厚さ0.3~0.5センチの透明アクリル板を使用し、アクリル板の表裏に白いパッドを貼り付けます。
次に、アクリル板の側面からライトが入り、平行に撃ち出せるように、プレートの端にLEDの白色ライトの列を取り付けます。次に、新しい6ウェル低接着プレートを準備し、各ウェルに2ミリリットルのEB形成培地を加える。1000マイクロリットル幅のボアピペットチップを用いて培地とともにEBを除去した後、1ウェルあたり約100EBを6ウェル低接着プレートに移す。
EB形成培地を毎日同じ体積の新鮮な培地で交換するために、ディッシュを円軌道に沿って回転させることによって旋回流を誘導する。EBまたはオルガノイドは、回転によって生成される二次流れのために井戸の中心に収束します。井戸の端にゆっくりとピペリングして古い媒体を吸引します。
あまりにも強く吸わないでください、さもなければEBは一緒に取り除かれます。次に、新しいメディアを追加して EB を再中断します。神経誘導のために、1ウェルあたり3ミリリットルの神経誘導培地を有する新しい6ウェル低接着プレートを準備する。
横方向のソフトライトをオンにし、他の屋内光源をオフにします。次に、EBsと培養培地の両方を吸引するために広い口のピペットチップを使用して神経誘導培地を添加した6ウェルプレートにEBsを移します。次に、ピペットを直立させます。
EBは重力下で徐々に沈み込み、ピペットチップの口に向かって収束します。ピペットチップの口が再び液面に触れると、液面張力によりEBは速やかに媒体に沈み込みます。サンプルを摂氏37度および5%二酸化炭素で24時間インキュベートします。
膜マトリックスを摂氏4度の冷蔵庫に60分間置き、溶解させる。横方向の柔らかいライトをオンにした後、コンソールの上部にある光源をオフにし、膜マトリックスを氷上に保ち、固化を防ぎます。少量のEBを新鮮な膨張媒体を含む60ミリメートルの皿に移して、単一のEBを除去しやすくする。幅200マイクロリットルのボアピペットチップを用いて、毎回約10マイクロリットルの培地を含む単一のEBを吸引し、それを6ウェルプレートの底部に添加して液滴を作る。
ウェルあたり5つの液滴を使用してください。15マイクロリットルの膜マトリックスを各EB含有滴に加える。EBボールを素早く混ぜ合わせ、液滴の中央に埋め込みます。
6つのウェルプレートを摂氏37度のインキュベーターに30分間入れることによって、EBを含む液滴が固化するのを待ちます。次に、3ミリリットルの膨張培地を各ウェルに加え、マトリックス埋め込みEBを静かに吹き飛ばして懸濁させ、3日間インキュベートします。オルガノイド成熟のために、元の培地を穏やかに取り出し、各ウェルに3ミリリットルの成熟培地を加える。
オルガノイドプレートを摂氏37度のインキュベーター内の水平シェーカーの上に置き、培養物を水平方向に回転させ続ける。新鮮な成熟培地を2〜3日ごとに交換します。重力と媒体よりも比較的高い密度のために、再懸濁されたEBは徐々に沈むでしょう。
したがって、EBは便利に転送できます。EBと比較して、遊離細胞および死細胞断片はよりゆっくりと沈む。したがって、ほとんどの遊離細胞および死細胞断片を除去することができる。
初期段階で栽培されたEBは、良好な多能性を示すOCT4マーカーを発現した。後の段階では、EBは成熟した脳オルガノイドに発達した。成熟大脳オルガノイドは、頂端前駆細胞マーカーPAX6およびニューロン特異的マーカーチューブリンJ1に対して陽性であった。健常人およびSCA3患者由来のiPS細胞をオルガノイドに成長させるために培養した。
正常大脳オルガノイド群とSCA3大脳オルガノイド群の遺伝子発現プロファイルは、神経伝達物質輸送、シナプス形成、調節などの経路に有意な差を示した。EBを基底膜マトリックスに埋め込む場合、EBの乾燥を避けるために操作時間が長すぎてはいけません。迅速に保護することをお勧めします。
