Il protocollo facilita il funzionamento della coltura di organoidi cerebrali e aiuta a promuovere l'applicazione di organoidi cerebrali. L'organoide dello stadio precedente può essere visto ad occhio nudo utilizzando una lampada laterale a luce morbida che è conveniente per molte operazioni. I metodi di cambio del mezzo migliorati e le operazioni di trasferimento degli organoidi sono utili anche per altri tipi di colture organoidiche e per la progettazione di macchine automatiche per colture.
Per iniziare, coltiva le iPSC con il mezzo mTeSR1 in una capsula di Petri da 35 millimetri coperta da matrigel e cambia il mezzo ogni giorno. La densità di crescita dell'iPSC non deve superare il 75%Quindi, pipettare il mezzo mTeSR1 dalle iPSC e lavarlo due volte con un millimetro di PBS. Dopo aver pipettato il PBS, aggiungere 300 microlitri di soluzione di distacco cellulare per digerire le iPSC in singole cellule per tre o quattro minuti a 37 gradi Celsius.
Successivamente, risospesare le cellule in due millimetri di terreno di formazione EB e centrifugare il campione per cinque minuti a 300 volte g. Trattare la piastra specializzata a 24 pozzetti con 500 microlitri per pozzetto di soluzione di risciacquo anti aderenza per cinque minuti. Ora, risospendare le cellule nel mezzo di formazione EB contenente l'inibitore della Rho chinasi Y27632.
Dopo aver rimosso la soluzione di risciacquo anti aderenza, sciacquare ciascuno con due millilitri di mezzo di formazione EB. Quindi, aggiungere le celle alle piastre specializzate a 24 pozzetti ad una densità di tre volte 10 alla sesta cella per pozzetto e centrifugare la piastra a 100 volte g per due minuti a temperatura ambiente. Distribuire uniformemente le celle in ogni camera nella parte inferiore della piastra.
Incubare i campioni a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 24 ore. Se la centrifugazione non è stata utilizzata nella fase precedente, incubare per 36 ore e mantenere il campione stabile. Utilizzare un pannello acrilico trasparente con uno spessore da 0,3 a 0,5 centimetri nel formato di carta A5 e incollare tamponi bianchi sulla parte anteriore e posteriore della lastra acrilica.
Quindi, installare una fila di luci bianche a LED sul bordo della piastra in modo che le luci possano entrare dal lato della piastra acrilica e quindi sparare in parallelo. Ora, preparare una nuova piastra a sei pozzetti a bassa adesione e aggiungere due millilitri di mezzo di formazione EB a ciascun pozzetto. Dopo aver rimosso gli EB insieme al mezzo utilizzando la punta della pipetta a foro largo di 1000 microlitri, trasferire circa 100 EB per pozzetto alla piastra a sei pozzetti a bassa adesione.
Per sostituire il mezzo di formazione EB ogni giorno con lo stesso volume di mezzo fresco, indurre un flusso vorticoso ruotando la parabola lungo un'orbita circolare. Gli EB o organoidi convergono al centro del pozzo a causa del flusso secondario generato attraverso la rotazione. Aspirare lentamente il vecchio mezzo convogliando verso il bordo del pozzo.
Non succhiare troppo forte, altrimenti gli EB verranno rimossi insieme. Quindi, aggiungere nuovi supporti per risospese gli EB. Per l'induzione neurale, preparare una nuova piastra di adesione a sei pozzi bassi con tre millilitri di mezzo di induzione neurale per pozzetto.
Accendere la luce soffusa laterale e spegnere altre fonti di luce interna. Ora trasferisci gli EB nella piastra a sei pozzetti con un mezzo di induzione neurale aggiunto utilizzando una punta a pipetta a bocca larga per succhiare sia gli EB che il terreno di coltura. Quindi, tenere la pipetta in posizione verticale.
Gli EB affonderanno gradualmente sotto gravità e convergeranno verso la bocca della punta della pipetta. Quando la bocca della punta della pipetta tocca nuovamente la superficie del liquido e, a causa della tensione superficiale del liquido, gli EB affondano rapidamente nel mezzo. Incubare i campioni a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 24 ore.
Posizionare la matrice di membrana in un frigorifero a quattro gradi Celsius per 60 minuti per dissolvere. Dopo aver acceso la luce morbida laterale, spegnere la sorgente luminosa sulla parte superiore della console e mantenere la matrice di membrana sul ghiaccio per evitare la solidificazione. Trasferire una piccola quantità di EB in un piatto da 60 millimetri contenente un mezzo di espansione fresco per facilitare la rimozione di un singolo EB. Utilizzando una punta di pipetta a foro largo 200 microlitri, aspirare un singolo EB contenente circa 10 microlitri medi ogni volta, quindi creare goccioline aggiungendolo sul fondo della piastra a sei pozzetti.
Utilizzare cinque goccioline per pozzetto. Aggiungere 15 microlitri della matrice di membrana a ciascuna goccia contenente EB. Mescolare rapidamente e incorporare la palla EB al centro della goccia.
Lasciare solidificare le goccioline contenenti EB posizionando la piastra a sei pozzetti in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, aggiungere tre millilitri del mezzo di espansione a ciascun pozzetto e far esplodere delicatamente gli EB incorporati nella matrice per sospenderli e incubarli per tre giorni. Per la maturazione organoide, rimuovere delicatamente il mezzo originale e aggiungere tre millilitri di terreno di maturazione a ciascun pozzetto.
Posizionare la piastra organoide su uno shaker orizzontale in un incubatore a 37 gradi Celsius e continuare a ruotare la coltura orizzontalmente. Cambiare il mezzo di maturazione fresco ogni due o tre giorni. A causa della gravità e della densità relativamente più elevata rispetto al mezzo, gli EB risospesi affonderanno gradualmente.
Quindi, gli EB possono essere comodamente trasferiti. Rispetto agli EB, le cellule libere e i frammenti di cellule morte affondano più lentamente. La maggior parte delle cellule libere e dei frammenti di cellule morte possono quindi essere rimossi.
Gli EB coltivati nella fase iniziale esprimevano il marcatore OCT4 che indicava una buona pluripotenza. Nella fase successiva, gli EB si sono sviluppati in organoidi cerebrali maturi. Gli organoidi cerebrali maturi erano positivi per il marcatore delle cellule progenitrici apicali PAX6 e per il marcatore specifico neuronale tubulinA J1. Le iPSC di individui sani e pazienti CON SCA3 sono state coltivate per crescere in organoidi.
I profili di espressione genica del normale gruppo organoide cerebrale e del gruppo organoide cerebrale SCA3 hanno mostrato differenze significative nei percorsi come il trasporto dei neurotrasmettitori, la formazione delle sinapsi e la regolazione. Quando si incorpora l'EB con la matrice della membrana basale, i tempi di funzionamento non devono essere troppo lunghi per evitare che gli EB si secchino. Si raccomanda di proteggere rapidamente.
