该协议有助于脑类器官培养的操作，并有助于促进脑类器官的应用。早期类器官可以通过使用横向柔光灯用肉眼看到，这对于许多操作来说很方便。改进的培养基更换方法和类器官转移操作也有助于其他类型的类器官培养和自动培养机的设计。

首先，将带有mTeSR1培养基的iPSC培养在覆盖有35毫米培养皿的基质中，并每天更换培养基。iPSC生长密度不得超过75%，然后从iPSC中移出mTeSR1培养基，并用一毫米PBS洗涤两次。移出PBS后，加入300微升细胞分离溶液，在37摄氏度下将iPSC消化到单个细胞中三到四分钟。

然后，将细胞重悬于两毫米的EB形成培养基中，并以300倍g离心样品五分钟。用每孔500微升的抗粘附冲洗溶液处理专门的24孔板五分钟。现在，将细胞重悬于含有Rho激酶抑制剂Y27632的EB形成培养基中。

除去抗粘附冲洗液后，用两毫升EB形成介质冲洗每个孔。接下来，将细胞以3乘以10的密度将细胞加入专门的24孔板中，并在室温下以100倍g离心板两分钟。将细胞均匀地分布在板底部的每个腔室中。

将样品在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育24小时。如果在上一步中未使用离心，请孵育36小时并保持样品稳定。使用厚度为0.3至0.5厘米的透明丙烯酸板，大小为A5纸，并在丙烯酸板的正面和背面粘贴白色垫。

接下来，在板的边缘安装一排LED白光灯，使灯可以从亚克力板的侧面进入，然后平行射出。现在，准备一个新的六孔低粘接板，并向每孔中加入两毫升EB形成培养基。使用1000微升宽孔移液器吸头将EB与培养基一起除去后，将每孔约100个EB转移到六孔低粘附板中。

为了每天用相同体积的新鲜培养基替换EB形成培养基，通过沿圆形轨道旋转培养皿来诱导涡流。由于通过旋转产生的二次流动，EB或类器官会聚到井的中心。通过缓慢地将移液到孔的边缘来吸入旧介质。

不要吸吮得太用力，否则EB会一起被移除。然后，添加新鲜介质以重悬 EB。对于神经诱导，制备一个新的六孔低粘附板，每孔有三毫升神经诱导介质。

打开侧向柔光灯并关闭其他室内光源。现在，通过使用宽口移液器吸头吸出EB和培养基，将EB转移到具有添加神经诱导培养基的六孔板中。然后，将移液器竖直。

EBs将在重力作用下逐渐下沉，并收敛到移液器吸头的口。当移液器吸头的口再次接触液体表面时，由于液体表面张力，EBs会迅速沉入介质中。将样品在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育24小时。

将膜基质放入四摄氏度的冰箱中溶解60分钟。打开侧向柔光灯后，关闭控制台顶部的光源，并将膜基质保持在冰上以防止凝固。将少量EB转移到含有新鲜膨胀培养基的60毫米培养皿中，以便更容易去除单个EB。使用200微升宽口径移液器吸头，每次吸出含有约10微升培养基的单个EB，然后通过将其添加到六孔板的底部来产生液滴。

每孔使用五个液滴。将15微升的膜基质加入每个含有EB的液滴中。快速混合EB球并将其嵌入液滴的中心。

通过将六孔板放入37摄氏度的培养箱中30分钟，使含有EB的液滴固化。然后，向每个孔中加入三毫升膨胀培养基，轻轻吹起嵌入的基质EB以悬浮它们并孵育三天。对于类器官成熟，轻轻除去原始培养基，并向每个孔中加入三毫升成熟培养基。

将类器官板放在37摄氏度培养箱中的水平振荡器上，并继续水平旋转培养物。每两到三天更换一次新鲜成熟培养基。由于重力和相对高于介质的密度，重悬的EB将逐渐下沉。

因此，可以方便地转移EB。与EBs相比，游离细胞和死细胞片段的下沉速度更慢。因此，可以去除大多数游离细胞和死细胞片段。

早期培养的EBs表达了OCT4标记，表明多能性良好。在后期阶段，EBs发育成成熟的脑类器官。成熟脑类器官对顶端祖细胞标志物PAX6和神经元特异性标志物微管蛋白J1呈阳性。来自健康个体和SCA3患者的iPSC被培养成类器官。

正常脑类器官组和SCA3脑类器官组的基因表达谱在神经递质转运、突触形成和调节等通路上存在显著差异。当用基底膜基质嵌入EB时，操作时间不应太长，以避免EB变干。建议快速保护。