Protokol, serebral organoidlerin kültürünün çalışmasını kolaylaştırır ve beyin organoidlerinin uygulanmasını teşvik etmeye yardımcı olur. Daha erken aşamadaki organoid, birçok işlem için uygun olan yanal yumuşak ışık lambası kullanılarak çıplak gözle görülebilir. Geliştirilmiş ortam değiştirme yöntemleri ve organoid transfer işlemleri, diğer organoid kültür türleri ve otomatik kültür makinelerinin tasarımı için de yararlıdır.
Başlamak için, bir matrijel içinde mTeSR1 ortamına sahip iPSC'leri kültürleyin, 35 milimetre Petri kabını kapladı ve ortamı her gün değiştirdi. iPSC büyüme yoğunluğu% 75'i geçmemelidirDaha sonra, mTeSR1 ortamını iPSC'lerden pipetle çıkarın ve bir milimetre PBS ile iki kez yıkayın. PBS'yi pipetledikten sonra, iPSC'leri 37 santigrat derecede üç ila dört dakika boyunca tek hücrelere sindirmek için 300 mikrolitre hücre ayırma çözeltisi ekleyin.
Daha sonra, hücreleri iki milimetre EB oluşum ortamında yeniden askıya alın ve numuneyi 300 kez g'de beş dakika boyunca santrifüj edin. Özel 24 kuyucuklu plakayı, beş dakika boyunca yapışma önleyici durulama çözeltisinin kuyusu başına 500 mikrolitre ile tedavi edin. Şimdi, Rho kinaz inhibitörü Y27632 içeren EB oluşum ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın.
Yapışma önleyici durulama çözeltisini çıkardıktan sonra, her bir oyuğa iki mililitre EB oluşum ortamı ile durulayın. Daha sonra, hücreleri özel 24 kuyu plakasına, kuyu başına altıncı hücrelere üç kez 10 yoğunlukta ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında iki dakika boyunca 100 kez g'de santrifüj edin. Hücreleri, plakanın altındaki her odaya eşit olarak dağıtın.
Numuneleri 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Önceki adımda santrifüjleme kullanılmadıysa, 36 saat boyunca inkübe edin ve numuneyi sabit tutun. A5 kağıt boyutunda 0,3 ila 0,5 santimetre kalınlığında şeffaf bir akrilik levha kullanın ve akrilik plakanın önüne ve arkasına beyaz pedler yapıştırın.
Ardından, plakanın kenarına bir sıra LED beyaz ışık takın, böylece ışıklar akrilik plakanın yanından girebilir ve ardından paralel olarak dışarı fırlayabilir. Şimdi, yeni bir altı kuyu düşük yapışma plakası hazırlayın ve her bir oyuğa iki mililitre EB oluşum ortamı ekleyin. 1000 mikrolitre genişliğinde delikli pipet ucu kullanarak EB'leri ortamla birlikte çıkardıktan sonra, kuyu başına yaklaşık 100 EB'yi altı kuyu alçak yapışma plakasına aktarın.
EB oluşum ortamını her gün aynı hacimde taze ortamla değiştirmek için, çanağı dairesel bir yörünge boyunca döndürerek bir girdap akışı indükleyin. EB'ler veya organoidler, dönme yoluyla üretilen ikincil akış nedeniyle kuyunun merkezine yaklaşır. Kuyunun kenarına yavaşça boru çekerek eski ortamı aspire edin.
Çok sert emmeyin, aksi takdirde EB'ler birlikte çıkarılacaktır. Ardından, EB'leri yeniden askıya almak için yeni medya ekleyin. Nöral indüksiyon için, kuyu başına üç mililitre nöral indüksiyon ortamı içeren yeni bir altı kuyu düşük yapışma plakası hazırlayın.
Yanal yumuşak ışığı açın ve diğer iç mekan ışık kaynaklarını kapatın. Şimdi EB'leri, hem EB'leri hem de kültür ortamını emmek için geniş ağızlı pipet ucu kullanarak nöral indüksiyon ortamı eklenmiş altı kuyucuklu plakaya aktarın. Ardından pipeti dik tutun.
EB'ler yavaş yavaş yerçekimi altında batacak ve pipet ucunun ağzına doğru birleşecektir. Pipet ucunun ağzı sıvı yüzeye tekrar dokunduğunda ve sıvı yüzey gerilimi nedeniyle, EB'ler hızla ortama batar. Numuneleri 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
Membran matrisini çözülmesi için 60 dakika boyunca dört santigrat derecelik bir buzdolabına yerleştirin. Yanal yumuşak ışığı açtıktan sonra, konsolun üstündeki ışık kaynağını kapatın ve katılaşmasını önlemek için membran matrisini buz üzerinde tutun. Tek EB'nin çıkarılmasını kolaylaştırmak için az miktarda EB'yi yeni bir genleşme ortamı içeren 60 milimetrelik bir kaba aktarın. 200 mikrolitre genişliğinde bir delikli pipet ucu kullanarak, her seferinde yaklaşık 10 mikrolitre ortam içeren tek bir EB'yi emin ve ardından altı kuyucuklu plakanın dibine ekleyerek damlacıklar yapın.
Kuyu başına beş damlacık kullanın. Damla içeren her EB'ye 15 mikrolitre membran matrisi ekleyin. EB topunu hızlıca karıştırın ve damlacığın ortasına yerleştirin.
EB'leri içeren damlacıkların, altı kuyucuklu plakayı 30 dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirerek katılaşmasına izin verin. Daha sonra, her bir kuyucuğa üç mililitre genleşme ortamı ekleyin ve matris gömülü EB'leri askıya almak ve üç gün boyunca kuluçkaya yatırmak için yavaşça havaya uçurun. Organoid olgunlaşma için, orijinal ortamı yavaşça çıkarın ve her bir oyuğa üç mililitre olgunlaşma ortamı ekleyin.
Organoid plakayı 37 santigrat derecelik bir inkübatörde yatay bir çalkalayıcıya yerleştirin ve kültürü yatay olarak döndürmeye devam edin. Taze olgunlaşma ortamını her iki ila üç günde bir değiştirin. Yerçekimi ve ortamdan nispeten daha yüksek yoğunluk nedeniyle, yeniden askıya alınan EB'ler yavaş yavaş batacaktır.
Bu nedenle, EB'ler rahatça aktarılabilir. EB'lerle karşılaştırıldığında, serbest hücreler ve ölü hücre parçaları daha yavaş batar. Böylece serbest hücrelerin ve ölü hücre parçalarının çoğu çıkarılabilir.
Erken aşamada yetiştirilen EB'ler, iyi pluripotensi gösteren OCT4 belirtecini ifade etti. Daha sonraki aşamada, EB'ler olgun serebral organoidlere dönüştü. Matür serebral organoidler apikal progenitör hücre markörü PAX6 ve nörona özgü marker tübülin J1 için pozitifti. Sağlıklı bireylerden ve SCA3 hastalarından gelen iPSC'ler, organoidlere dönüşmek üzere yetiştirildi.
Normal serebral organoid grubunun ve SCA3 serebral organoid grubunun gen ekspresyon profilleri, nörotransmitter transportu, sinaps oluşumu ve regülasyon gibi yollarda anlamlı farklılıklar gösterdi. EB'yi bazal membran matrisi ile gömerken, EB'lerin kurumasını önlemek için çalışma süreleri çok uzun olmamalıdır. Hızlı bir şekilde korunması tavsiye edilir.
