Протокол облегчает работу культуры церебральных органоидов и способствует применению органоидов головного мозга. Органоид более ранней стадии можно увидеть невооруженным глазом с помощью боковой лампы мягкого света, которая удобна для многих операций. Улучшенные методы изменения среды и операции переноса органоидов также полезны для других типов органоидных культур и проектирования автоматических машин для культур.
Для начала культивируйте иПСК со средой mTeSR1 в матригеле, покрытом 35-миллиметровой чашкой Петри, и меняйте среду каждый день. Плотность роста iPSC не должна превышать 75% Затем вынимайте среду mTeSR1 из iPSCs и дважды промывайте ее одним миллиметром PBS. После пипетирования PBS добавьте 300 микролитров раствора для отсоединения клеток, чтобы переварить iPSCs в отдельные клетки в течение трех-четырех минут при 37 градусах Цельсия.
Позже повторно суспендируют клетки в двух миллиметрах ЭБ-пластовой среды и центрифугируют образец в течение пяти минут при 300 раз больше г. Обработайте специализированную пластину из 24 лунок 500 микролитрами на лунку антиадгезивного промывочного раствора в течение пяти минут. Теперь повторно суспендируют клетки в среде формирования EB, содержащей ингибитор Rho-киназы Y27632.
После удаления антиадгезивного промывочного раствора промыть каждую лунку двумя миллилитрами ЭБ-пластовой среды. Далее добавляют ячейки к специализированным 24 пластинам скважины с плотностью от трех раз 10 до шестой ячейки на лунку и центрифугируют пластину в 100 раз г в течение двух минут при комнатной температуре. Равномерно распределите ячейки в каждой камере в нижней части пластины.
Инкубируйте образцы при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов. Если центрифугирование не использовалось на предыдущей стадии, инкубируйте в течение 36 часов и держите образец стабильным. Используйте прозрачную акриловую доску толщиной от 0,3 до 0,5 сантиметра размером с бумагу формата А5 и наклейте белые прокладки на лицевую и заднюю части акриловой пластины.
Затем установите ряд светодиодных белых огней на краю пластины, чтобы огни могли входить со стороны акриловой пластины, а затем выстреливать параллельно. Теперь подготовьте новую пластину с низкой адгезией из шести лунок и добавьте в каждую скважину по два миллилитра ЭБ-пластовой среды. После удаления ЭБ вместе со средой с использованием наконечника пипетки шириной 1000 микролитров перенесите приблизительно 100 ЭБ на скважину на шестилуночную пластину с низкой адгезией.
Чтобы каждый день заменять среду формирования EB одним и тем же объемом свежей среды, индуцируйте поток вихря, вращая тарелку по круговой орбите. ЭБ или органоиды сходятся к центру скважины из-за вторичного потока, генерируемого вращением. Аспирируйте старую среду, медленно направляя ее к краю колодца.
Не сосите слишком сильно, иначе ЭБ будут удалены вместе. Затем добавьте свежие носители, чтобы повторно использовать ЭБ. Для нейронной индукции подготовьте новую пластину с шестью лунками с низкой адгезией с тремя миллилитрами среды нейронной индукции на лунку.
Включите боковой мягкий свет и выключите другие внутренние источники света. Теперь перенесите ЭБ на пластину с шестью лунками с добавлением нейронной индукционной среды, используя широкий наконечник пипетки для всасывания как ЭБ, так и питательной среды. Затем держите пипетку в вертикальном положении.
ЭБ будут постепенно погружаться под действием силы тяжести и сходиться к устью кончика пипетки. Когда горлышко кончика пипетки снова касается поверхности жидкости, и из-за поверхностного натяжения жидкости ЭБ быстро погружаются в среду. Инкубируйте образцы при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов.
Поместите мембранную матрицу в холодильник с температурой четыре градуса Цельсия на 60 минут, чтобы раствориться. После включения бокового мягкого света выключите источник света в верхней части консоли и держите мембранную матрицу на льду, чтобы предотвратить затвердевание. Переложите небольшое количество ЭБ в 60-миллиметровую посуду, содержащую свежую расширительную среду, чтобы было легче удалить один ЭБ. Используя наконечник пипетки шириной 200 микролитров, всасывайте один ЭБ, содержащий примерно 10 микролитров среды каждый раз, а затем делайте капли, добавляя его к нижней части пластины из шести скважин.
Используйте по пять капель на лунку. Добавьте 15 микролитров мембранной матрицы к каждой капле, содержащей ЭБ. Быстро перемешайте и вставьте шарик EB в центр капли.
Дайте каплям, содержащим ЭБ, затвердеть, поместив пластину из шести лунок в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем добавьте три миллилитра расширительной среды к каждой скважине и осторожно взорвите матрицу встроенных ЭБ, чтобы приостановить их и инкубировать в течение трех дней. Для созревания органоидов аккуратно удалите исходную среду и добавьте три миллилитра среды созревания в каждую лунку.
Поместите органоидную пластину на горизонтальный шейкер в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и продолжайте вращать культуру горизонтально. Меняйте свежую среду созревания каждые два-три дня. Из-за гравитации и относительно более высокой плотности, чем среда, повторно суспендированные ЭБ будут постепенно опускаться.
Следовательно, ЭБ могут быть удобно переданы. По сравнению с ЭБ, свободные клетки и фрагменты мертвых клеток тонут медленнее. Таким образом, большинство свободных клеток и фрагментов мертвых клеток могут быть удалены.
ЭБ, культивируемые на ранней стадии, выражали маркер OCT4, который указывал на хорошую плюрипотентность. На более поздней стадии ЭБ развились в зрелые церебральные органоиды. Зрелые церебральные органоиды были положительными для маркера клеток-предшественников Апикальных клеток PAX6 и нейрон-специфического маркера тубулина J1. ИПСК от здоровых людей и пациентов с SCA3 культивировались для роста в органоиды.
Профили экспрессии генов нормальной церебральной органоидной группы и церебральной органоидной группы SCA3 показали значительные различия в путях, таких как транспорт нейротрансмиттеров, образование синапсов и регуляция. При встраивании ЭБ с базальной мембранной матрицей время работы не должно быть слишком длительным, чтобы избежать высыхания ЭБ. Рекомендуется быстро защищать.
