Le protocole facilite le fonctionnement de la culture d’organoïdes cérébraux et aide à promouvoir l’application d’organoïdes cérébraux. L’organoïde à un stade précoce peut être vu à l’œil nu en utilisant une lampe à lumière douce latérale qui est pratique pour de nombreuses opérations. Les méthodes améliorées de changement de milieu et les opérations de transfert organoïde sont également utiles pour d’autres types de cultures organoïdes et la conception de machines de cultures automatiques.
Pour commencer, cultivez les iPSC avec un milieu mTeSR1 dans une boîte de Petri de 35 millimètres recouverte de matrigel et changez le milieu tous les jours. La densité de croissance iPSC ne doit pas dépasser 75% Ensuite, pipetez le milieu mTeSR1 des iPSC et lavez-le deux fois avec un millimètre de PBS. Après avoir pipeté le PBS, ajoutez 300 microlitres de solution de détachement cellulaire pour digérer les CSPi en cellules individuelles pendant trois à quatre minutes à 37 degrés Celsius.
Plus tard, remettez en suspension les cellules dans deux millimètres de milieu de formation EB et centrifugez l’échantillon pendant cinq minutes à 300 fois g. Traiter la plaque spécialisée de 24 puits avec 500 microlitres par puits de solution de rinçage antiadhésive pendant cinq minutes. Maintenant, ressuspendez les cellules dans le milieu de formation EB contenant l’inhibiteur de rho kinase Y27632.
Après avoir retiré la solution de rinçage antiadhésive, rincez chaque puits avec deux millilitres de milieu de formation EB. Ensuite, ajoutez les cellules aux 24 plaques de puits spécialisées à une densité de trois fois 10 aux sixièmes cellules par puits et centrifugez la plaque à 100 fois g pendant deux minutes à température ambiante. Répartir uniformément les cellules dans chaque chambre au bas de la plaque.
Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Si la centrifugation n’a pas été utilisée à l’étape précédente, incuber pendant 36 heures et maintenir l’échantillon stable. Utilisez un panneau acrylique transparent d’une épaisseur de 0,3 à 0,5 centimètres de la taille d’un papier A5 et collez des tampons blancs à l’avant et à l’arrière de la plaque acrylique.
Ensuite, installez une rangée de lumières blanches LED sur le bord de la plaque afin que les lumières puissent entrer par le côté de la plaque acrylique, puis tirer en parallèle. Maintenant, préparez une nouvelle plaque à faible adhérence de six puits et ajoutez deux millilitres de milieu de formation EB à chaque puits. Après avoir retiré les EB avec le milieu à l’aide de la pointe de pipette à alésage large de 1000 microlitres, transférez environ 100 EB par puits vers la plaque de faible adhérence de six puits.
Pour remplacer le milieu de formation EB tous les jours par le même volume de milieu frais, induire un flux tourbillonnant en faisant pivoter la parabole le long d’une orbite circulaire. Les EB ou organoïdes convergent vers le centre du puits en raison du flux secondaire généré par la rotation. Aspirer l’ancien milieu en canalisant lentement jusqu’au bord du puits.
Ne pas sucer trop fort, sinon les EB seront enlevés ensemble. Ensuite, ajoutez de nouveaux médias pour remettre en suspension les EB. Pour l’induction neuronale, préparez une nouvelle plaque à six puits à faible adhérence avec trois millilitres de milieu d’induction neuronal par puits.
Allumez la lumière douce latérale et éteignez les autres sources de lumière intérieure. Maintenant, transférez les EB dans la plaque à six puits avec un milieu d’induction neuronal ajouté en utilisant une pointe de pipette à bouche large pour aspirer à la fois les EB et le milieu de culture. Ensuite, tenez la pipette à la verticale.
Les EB s’enfonceront progressivement sous la gravité et convergeront vers l’embouchure de la pointe de la pipette. Lorsque la bouche de la pointe de la pipette touche à nouveau la surface du liquide et, en raison de la tension superficielle du liquide, les EB s’enfoncent rapidement dans le milieu. Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures.
Placez la matrice membranaire dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant 60 minutes pour la dissoudre. Après avoir allumé la lumière douce latérale, éteignez la source lumineuse sur le dessus de la console et maintenez la matrice de membrane sur la glace pour éviter la solidification. Transférez une petite quantité d’EB dans un plat de 60 millimètres contenant un milieu d’expansion frais pour faciliter l’élimination d’un seul EB. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres de large, aspirez un seul EB contenant environ 10 microlitres à chaque fois, puis faites des gouttelettes en l’ajoutant au fond de la plaque de six puits.
Utilisez cinq gouttelettes par puits. Ajouter 15 microlitres de la matrice membranaire à chaque EB contenant de la goutte. Mélangez et incorporez rapidement la boule EB au centre de la gouttelette.
Laissez les gouttelettes contenant des EB se solidifier en plaçant la plaque de six puits dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, ajoutez trois millilitres de milieu d’expansion à chaque puits et faites sauter doucement les EB intégrés à la matrice pour les suspendre et incuber pendant trois jours. Pour la maturation organoïde, retirez doucement le milieu d’origine et ajoutez trois millilitres de milieu de maturation à chaque puits.
Placez la plaque organoïde sur un agitateur horizontal dans un incubateur à 37 degrés Celsius et continuez à faire pivoter la culture horizontalement. Changez le milieu de maturation frais tous les deux à trois jours. En raison de la gravité et de la densité relativement plus élevée que le milieu, les EB remis en suspension vont progressivement couler.
Par conséquent, les EB peuvent être facilement transférés. Par rapport aux EB, les cellules libres et les fragments de cellules mortes coulent plus lentement. La plupart des cellules libres et des fragments de cellules mortes peuvent ainsi être éliminés.
Les EB cultivés au stade précoce ont exprimé le marqueur OCT4 qui indiquait une bonne pluripotence. Dans la dernière étape, les EB se sont développés en organoïdes cérébraux matures. Les organoïdes cérébraux matures étaient positifs pour le marqueur des cellules progénitrices apicales PAX6 et le marqueur spécifique des neurones, la tubuline J1. Les CSPi d’individus en bonne santé et de patients atteints de SCA3 ont été cultivés pour devenir des organoïdes.
Les profils d’expression génique du groupe organoïde cérébral normal et du groupe organoïde cérébral SCA3 ont montré des différences significatives dans les voies telles que le transport des neurotransmetteurs, la formation de synapses et la régulation. Lors de l’intégration de l’EB avec la matrice de la membrane basale, les temps de fonctionnement ne doivent pas être trop longs pour éviter le dessèchement des EB. Il est recommandé de protéger rapidement.
