El protocolo facilita el funcionamiento del cultivo de organoides cerebrales y ayuda a promover la aplicación de organoides cerebrales. El organoide en etapa anterior se puede ver a simple vista mediante el uso de una lámpara lateral de luz suave que es conveniente para muchas operaciones. Los métodos mejorados de cambio de medio y las operaciones de transferencia de organoides también son útiles para otros tipos de cultivos de organoides y el diseño de máquinas de cultivos automáticos.
Para empezar, cultiva las iPSCs con medio mTeSR1 en una placa de Petri de 35 milímetros cubierta de matrigel y cambia el medio todos los días. La densidad de crecimiento de iPSC no debe exceder el 75%Luego, pipetee el medio mTeSR1 de los iPSC y lávelo dos veces con un milímetro de PBS. Después de pipetear el PBS, agregue 300 microlitros de solución de desprendimiento celular para digerir las iPSC en células individuales durante tres o cuatro minutos a 37 grados centígrados.
Más tarde, resuspend las células en dos milímetros de medio de formación EB y centrifugar la muestra durante cinco minutos a 300 veces g. Trate la placa especializada de 24 pocillos con 500 microlitros por pocillo de solución de enjuague anti adherencia durante cinco minutos. Ahora, resuspend las células en el medio de formación de EB que contiene el inhibidor de la Rho quinasa Y27632.
Después de retirar la solución de enjuague anti adherencia, enjuague cada pozo con dos mililitros de medio de formación EB. A continuación, agregue las células a las placas especializadas de 24 pocillos a una densidad de tres veces 10 a la sexta celda por pozo y centrifugue la placa a 100 veces g durante dos minutos a temperatura ambiente. Distribuya uniformemente las celdas en cada cámara en la parte inferior de la placa.
Incubar las muestras a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Si no se utilizó la centrifugación en el paso anterior, incube durante 36 horas y mantenga la muestra estable. Use una placa acrílica transparente con un grosor de 0.3 a 0.5 centímetros en el tamaño de papel A5 y pegue almohadillas blancas en la parte frontal y posterior de la placa acrílica.
A continuación, instale una fila de luces blancas LED en el borde de la placa para que las luces puedan ingresar desde el lado de la placa acrílica y luego disparar en paralelo. Ahora, prepare una nueva placa de baja adherencia de seis pozos y agregue dos mililitros de medio de formación EB a cada pozo. Después de retirar los EB junto con el medio utilizando la punta de pipeta de diámetro ancho de 1000 microlitros, transfiera aproximadamente 100 EB por pozo a la placa de baja adherencia de seis pozos.
Para reemplazar el medio de formación EB todos los días con el mismo volumen de medio fresco, induzca un flujo de remolino girando el plato a lo largo de una órbita circular. Los EB u organoides convergen al centro del pozo debido al flujo secundario generado a través de la rotación. Aspire el medio viejo canalizando hacia el borde del pozo lentamente.
No chupe demasiado fuerte, de lo contrario los EB se eliminarán juntos. Luego, agregue medios nuevos para volver a suspender los EB. Para la inducción neural, prepare una nueva placa de adhesión baja de seis pocillos con tres mililitros de medio de inducción neural por pozo.
Encienda la luz suave lateral y apague otras fuentes de luz interiores. Ahora transfiera los EB a la placa de seis pocillos con medio de inducción neural agregado mediante el uso de una punta de pipeta de boca ancha para succionar tanto los EB como el medio de cultivo. Luego, sostenga la pipeta en posición vertical.
Los EB se hundirán gradualmente bajo la gravedad y convergerán hacia la boca de la punta de la pipeta. A medida que la boca de la punta de la pipeta toca la superficie líquida nuevamente, y debido a la tensión de la superficie del líquido, los EB se hunden rápidamente en el medio. Incubar las muestras a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas.
Coloque la matriz de membrana en un refrigerador de cuatro grados Celsius durante 60 minutos para disolverla. Después de encender la luz suave lateral, apague la fuente de luz en la parte superior de la consola y mantenga la matriz de membrana sobre hielo para evitar la solidificación. Transfiera una pequeña cantidad de EB a un plato de 60 milímetros que contenga un medio de expansión fresco para facilitar la eliminación de un solo EB. Usando una punta de pipeta de diámetro ancho de 200 microlitros, succione un solo EB que contenga aproximadamente 10 microlitros de medio cada vez, y luego haga gotas agregándolo a la parte inferior de la placa de seis pozos.
Use cinco gotas por pozo. Agregue 15 microlitros de la matriz de membrana a cada gota que contenga EB. Mezcle e incruste rápidamente la bola EB en el centro de la gota.
Permita que las gotas que contienen EB se solidifiquen colocando la placa de seis pocillos en una incubadora de 37 grados Celsius durante 30 minutos. Luego, agregue tres mililitros del medio de expansión a cada pozo y explote suavemente los EB incrustados en la matriz para suspenderlos e incubarlos durante tres días. Para la maduración organoide, retire suavemente el medio original y agregue tres mililitros de medio de maduración a cada pozo.
Coloque la placa organoide en un agitador horizontal en una incubadora de 37 grados Celsius y continúe girando el cultivo horizontalmente. Cambie el medio de maduración fresco cada dos o tres días. Debido a la gravedad y a una densidad relativamente mayor que el medio, los EB resuspendidos se hundirán gradualmente.
Por lo tanto, los EB se pueden transferir convenientemente. En comparación con los EB, las células libres y los fragmentos de células muertas se hunden más lentamente. Por lo tanto, la mayoría de las células libres y los fragmentos de células muertas se pueden eliminar.
Los EB cultivados en la etapa inicial expresaron el marcador OCT4 que indicaba una buena pluripotencia. En la etapa posterior, los EB se convirtieron en organoides cerebrales maduros. Los organoides cerebrales maduros fueron positivos para el marcador de células progenitoras apicales PAX6 y el marcador específico de neuronas tubulina J1. Las iPSC de individuos sanos y pacientes con SCA3 se cultivaron para convertirse en organoides.
Los perfiles de expresión génica del grupo organoide cerebral normal y del grupo organoide cerebral SCA3 mostraron diferencias significativas en vías como el transporte de neurotransmisores, la formación de sinapsis y la regulación. Al incrustar el EB con matriz de membrana basal, los tiempos de operación no deben ser demasiado largos para evitar que los EB se sequen. Se recomienda proteger rápidamente.
