이 프로토콜은 대뇌 오가노이드 문화의 작동을 용이하게하고 뇌 오가노이드의 적용을 촉진하는 데 도움이됩니다. 초기 단계의 오가노이드는 많은 작업에 편리한 측면 소프트 라이트 램프를 사용하여 육안으로 볼 수 있습니다. 향상된 배지 변경 방법 및 오가노이드 전달 작업은 다른 유형의 오가노이드 배양 및 자동 배양 기계 설계에도 도움이됩니다.
시작하기 위해, iPSCs를 35 밀리미터 페트리 디쉬로 덮인 마트리겔에서 mTeSR1 배지로 배양하고 매일 배지를 변경한다. iPSC 성장 밀도는 75%를 초과하지 않아야 하며, 이어서, iPSCs로부터 mTeSR1 배지를 피펫팅하고 이를 PBS 1밀리미터로 두 번 세척한다. PBS를 피펫팅한 후, 300 마이크로리터의 세포 분리 용액을 첨가하여 iPSCs를 섭씨 37도에서 3 내지 네 분 동안 단일 세포로 소화시킨다.
나중에, 세포를 두 밀리미터의 EB 형성 배지에 재현탁시키고, 샘플을 300배 g에서 5분 동안 원심분리한다. 전문화 된 24 웰 플레이트를 웰 당 500 마이크로 리터의 부착 방지 헹굼 용액으로 5 분 동안 처리하십시오. 이제, 세포를 Rho 키나제 억제제 Y27632를 함유하는 EB 형성 배지에 재현탁시킨다.
순응 방지 헹굼 용액을 제거한 후, 두 밀리리터의 EB 형성 매질로 각 웰을 헹구십시오. 다음으로, 세포를 웰 당 여섯 번째 세포에 세 번 10의 밀도로 전문화된 24 웰 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 2분 동안 100배 g에서 원심분리한다. 플레이트의 바닥에있는 각 챔버에 세포를 균일하게 분배하십시오.
샘플을 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 원심분리가 이전 단계에서 사용되지 않은 경우, 36시간 동안 인큐베이션하고 샘플을 안정적으로 유지한다. A5 용지 크기의 두께가 0.3 ~ 0.5cm인 투명 아크릴 보드를 사용하고 아크릴 판의 앞면과 뒷면에 흰색 패드를 붙여 넣으십시오.
그런 다음 아크릴 판의 측면에서 조명이 들어갈 수 있도록 플레이트 가장자리에 LED 흰색 조명 행을 설치 한 다음 병렬로 쏠 수 있습니다. 이제 새로운 여섯 개의 우물 낮은 접착 플레이트를 준비하고 각 웰에 두 밀리리터의 EB 형성 배지를 추가하십시오. 1000 마이크로리터의 넓은 보어 피펫 팁을 사용하여 배지와 함께 EB를 제거한 후, 웰당 약 100개의 EB를 여섯 개의 웰 저 접착 플레이트로 옮깁니다.
EB 형성 배지를 매일 동일한 부피의 신선한 배지로 교체하려면 접시를 원형 궤도를 따라 회전시켜 소용돌이 흐름을 유도하십시오. EB 또는 오가노이드는 회전을 통해 생성 된 이차 흐름으로 인해 우물의 중심으로 수렴합니다. 우물의 가장자리로 천천히 파이프하여 오래된 매체를 흡인하십시오.
너무 열심히 빨지 말고, 그렇지 않으면 EB가 함께 제거됩니다. 그런 다음 새 미디어를 추가하여 EB를 다시 일시 중단합니다. 신경 유도를 위해, 웰 당 세 밀리리터의 신경 유도 매질로 새로운 여섯 개의 웰 낮은 접착 플레이트를 준비하십시오.
측면 소프트 라이트를 켜고 다른 실내 광원을 끕니다. 이제 EB를 EBs와 배양 배지 모두를 빨아들이기 위해 넓은 입 피펫 팁을 사용하여 신경 유도 배지가 첨가 된 여섯 웰 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 피펫을 똑바로 잡으십시오.
EB는 중력 하에서 점차적으로 가라 앉고 피펫 팁의 입쪽으로 수렴합니다. 피펫 팁의 입이 액체 표면에 다시 닿으면 액체 표면 장력으로 인해 EB가 빠르게 매체에 가라 앉습니다. 샘플을 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
멤브레인 매트릭스를 섭씨 4도 냉장고에 60분 동안 놓고 용해시킨다. 측면 소프트 라이트를 켠 후 콘솔 상단의 광원을 끄고 멤브레인 매트릭스를 얼음 위에 두어 응고를 방지하십시오. 소량의 EB를 신선한 확장 매체가 들어있는 60mm 접시로 옮겨 단일 EB를 쉽게 제거 할 수 있습니다. 200 마이크로 리터의 넓은 보어 피펫 팁을 사용하여 매번 약 10 마이크로 리터의 배지가 들어있는 단일 EB를 빨아 들인 다음 여섯 웰 플레이트의 바닥에 추가하여 물방울을 만듭니다.
우물 당 다섯 방울을 사용하십시오. 15 마이크로리터의 막 매트릭스를 방울을 함유하는 각각의 EB에 첨가한다. EB 볼을 빠르게 섞어서 물방울 중앙에 끼워 넣으십시오.
EB를 함유하는 액적이 6개의 웰 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터에 30분 동안 위치시켜 응고되도록 허용한다. 그런 다음, 세 밀리리터의 팽창 배지를 각 웰에 첨가하고, 매트릭스 임베디드 EB를 부드럽게 날려 이들을 현탁시키고 사흘 동안 인큐베이션한다. 오가노이드 성숙을 위해, 원래의 배지를 부드럽게 제거하고 각 웰에 세 밀리리터의 성숙 배지를 첨가하십시오.
오가노이드 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터의 수평 진탕기 위에 놓고 배양물을 수평으로 계속 회전시킨다. 신선한 성숙 배지를 이틀에서 사흘마다 바꿉니다. 중력과 매체보다 상대적으로 높은 밀도로 인해 재현탁 된 EB는 점차 가라 앉을 것입니다.
따라서 EB를 편리하게 전송할 수 있습니다. EB와 비교할 때, 자유 세포와 죽은 세포 조각은 더 천천히 가라 앉습니다. 따라서 대부분의 자유 세포 및 죽은 세포 단편은 제거될 수 있다.
초기 단계에서 재배 된 EB는 좋은 다능성을 나타내는 OCT4 마커를 표현했습니다. 후기 단계에서 EB는 성숙한 대뇌 오가노이드로 발전했습니다. 성숙한 대뇌 오가노이드는 정점 전구 세포 마커 PAX6 및 뉴런 특이적 마커 튜불린 J1에 대해 양성이었다. 건강한 개인과 SCA3 환자의 iPSCs를 오가노이드로 성장시키기 위해 배양하였다.
정상 뇌 오가노이드 그룹과 SCA3 대뇌 오가노이드 그룹의 유전자 발현 프로필은 신경 전달 물질 수송, 시냅스 형성 및 조절과 같은 경로에서 유의한 차이를 보였다. EB를 기저막 매트릭스에 내장할 때 EB가 건조되는 것을 피하기 위해 작동 시간이 너무 길어서는 안 됩니다. 신속하게 보호하는 것이 좋습니다.
