يمكن لهذا البروتوكول أن يحقق نتائج تجريبية بشكل حدسي مثل النمط الظاهري للعظام ومؤشرات التمثيل الغذائي وما إلى ذلك. التطبيق الرئيسي لهذه التجربة هو التصوير المقطعي المحوسب الصغير ، والذي يمكن أن يقوم بإعادة بناء الأنسجة ثلاثية الأبعاد لتحليل مورفولوجيا العظام ، وهو أكبر على أساسها من عينات الجلد. لبدء الإجراء ، ضع تسكين موضعي بحقن موضعي من بوبيفاكائين على فأر مخدر بشكل صحيح.
ثم استخدم كرة قطنية معقمة لتطهير المنطقة المحلوقة بالإيثانول واليود بوفيدون ثلاث مرات. باستخدام مشرط ، قم بإجراء شق خط الوسط بطول سنتيمترين على بطن. كشف المبيض السليم باستخدام الملقط وربطه في جذر المبيض باستخدام خياطة جراحية 4-0.
قم بإزالة المبيض السليم باستخدام مقص جراحي قبل خياطة شق خط الوسط. بعد إعطاء الدواء في المعدة لمدة أربعة أشهر وتخدير ، قم بقص وتقشير جلد الفخذ لكشف الشريان الفخذي باستخدام المقص الجراحي والملاقط. اجمع عينة دم من الشريان الفخذي باستخدام أنبوب جمع دم مفرغ.
ثم اضغط بكرة قطنية لوقف النزيف. استمر في قص وتقشير جلد الفخذ في الطرف السفلي لفضح الساق السليمة. قم بإزالة الساق واغسله ثلاث مرات بالمحلول الملحي.
باستخدام الملقط ومقص العيون ، قم بإزالة الأنسجة العضلية الزائدة من الساق الموضوعة في محلول ملحي. تطهير الجلد الخلفي لأسفل الظهر L4 ثلاث مرات بالإيثانول واليود بوفيدون باستخدام كرة قطنية معقمة. استخدم المقص والملاقط الجراحية لقص جلد الظهر وفضح الجزء القطني L4. اقطع الفقرات العلوية والسفلية لأسفل الظهر L4 بقطعة وقطع العجز المحيط بها بمقص جراحي.
قم بإزالة الأنسجة العضلية الزائدة من أسفل الظهر المغسول L4 الموضوعة في محلول ملحي باستخدام ملاقط ومقص دقيق. قم بتخزين الساق وفقرة L4 في سائل أنسجة الفورمالين بنسبة 10٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاثة أيام. بعد تشغيل الماسح الضوئي المقطعي المحوسب الصغير ، ابدأ تشغيل البرنامج لتسخين مصدر الأشعة السينية.
قم بإنشاء قاعدة بيانات بالنقر فوق إنشاء نموذج جديد لإنشاء ملف لحفظ البيانات قبل الحصول على الملف التالي. في نافذة التحكم في البرنامج، قم بتعيين معلمات الحصول على البيانات. اضبط جهد أنبوب الأشعة السينية على 50 كيلو فولت ، وتيار أنبوب الأشعة السينية المقطعي المحوسب وتيار أنبوب الأشعة السينية الحي على 100 ميكرو أمبير ، ومجال الرؤية إلى 18 ملم ، وعدم وجود تقنية بوابات ، وتقنية المسح بدقة عالية في أربع دقائق.
بعد غسل الساق بالمحلول الملحي ثلاث مرات ، امسح الماء الزائد بورق الترشيح. لف منديل الساق على السرير بغشاء بلاستيكي لإصلاح موضعه. اضبط أنسجة الساق على مركز مجال التصوير عن طريق تدوير الزر الموجود في الجهاز.
أغلق باب الجهاز وقم بتشغيل الوضع المباشر. اضغط على زر الالتقاط لعرض أنسجة الظنبوب. ابدأ الفحص بالنقر فوق الزر التصوير المقطعي المحوسب.
انقر فوق نعم لإنتاج الصورة. انقر فوق حفظ الصورة لحفظ الصورة في المجلد المطلوب. انقل عينات الظنبوب والفقرات L4 المخزنة مسبقا في محلول حمض الفورمالين بنسبة 10٪ إلى 20٪ من حمض الفورميك لمدة أربعة أيام.
بعد إزالة الكلس، اغسل الساق والفقرة L4 الموضوعة في صندوق التضمين بالماء الجاري لأكثر من ست ساعات. تجفيف العينات باستخدام محاليل الكحول ذات التركيز المتدرج في معالج الأنسجة الآلي. ضع عينات الأنسجة في الزيلين لمدة ساعتين لجعلها شفافة.
ثم ضع العينات المتنفذة في شمع البارافين عند 60 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات قبل دمجها في معالج أوتوماتيكي. احصل على أقسام أنسجة 4 ميكرون باستخدام قطاعة دوارة. ضع الأقسام في بقعة الهيماتوكسيلين لمدة ثلاث إلى ثماني دقائق وبقعة اليوزين لمدة دقيقة إلى ثلاث دقائق.
انقل الأجزاء الملطخة بالتتابع إلى الكحول النقي والزيلين. أغلق الأقسام وثبتها بعلكة محايدة لعرضها تحت المجهر البصري. لإجراء استرجاع الحاتمة الناجمة عن الحرارة على أقسام الساق ، ضع الورقة الحاملة في المخزن المؤقت المناسب لإصلاح المستضد في حاوية يمكن تسخينها في الميكروويف.
لإصلاح المستضد ، ضع الحاوية في الميكروويف لمدة 20 دقيقة عند 98 درجة مئوية. بعد إزالة الحاوية ، اشطفها من الداخل بماء الصنبور البارد لمدة 10 دقائق. لمنع نشاط البيروكسيديز الداخلي ، احتضان شرائح الساق بنسبة 3٪ بيروكسيد الهيدروجين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
اغسل الأقسام في PBS ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها. ثم احتضان العينات بمحلول عادي لحجب مصل الماعز في غرفة رطبة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أضف 200 ميكرولتر من كل من الأجسام المضادة RANKL أو osteoprotegerin أو OPG والسكليروستين في عينات الشريحة ، واحتضان العينات طوال الليل عند أربع درجات مئوية في الظلام.
بعد ذلك ، احتضان الأقسام باستخدام IgG مضاد للأرانب من الماعز المسمى بالبيوتين في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد شطف مع PBS ، استخدم diaminobenzidine لتلطيخ تلك لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. صبغ الأقسام بالهيماتوكسيلين لمدة دقيقة إلى دقيقتين قبل إغلاق الأقسام المجففة والمجففة بالعلكة المحايدة.
أضف 25 ميكرولترا من العينة الخاضعة للرقابة أو القياسية أو العينة إلى كل بئر من الآبار الخاصة بهم. ثم أضف 200 ميكرولتر من 17 بيتا استراديول HRP مترافق لكل بئر. غطي جميع الآبار بورق الألمنيوم واحتضان الصفيحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
بعد إزالة السائل من كل بئر ، اغسل الآبار ثلاث مرات ب 300 ميكرولتر من محلول الغسيل 1X. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة TMB إلى كل بئر واحتضانه. بعد الحضانة ، أضف 100 ميكرولتر من محلول التوقف لكل بئر.
رج صفيحة العيار الصغير برفق لمدة 30 ثانية قبل قياس امتصاص العينة عند 450 نانومتر في غضون 30 دقيقة. كشفت صور التصوير المقطعي المحوسب الدقيقة المعاد بناؤها للساق الأيمن أن التغيرات الهيكلية التربيقية الناجمة عن استئصال المبيض والتي شوهدت في مجموعة OVX النموذجية قد انخفضت بشكل كبير في الفئران المبيضة المعالجة بكبسولة Bazi Bushen أو مجموعة BZBS. بالمقارنة مع مجموعة SHAM ، أظهر العظم التربيقي في مجموعة OVX انخفاضا كبيرا في كثافة المعادن في العظام.
لوحظ اتجاه مماثل لجزء حجم العظام وعدد التربيق العظمي وسمك التربيق العظمي. لوحظ اتجاه معاكس لدرجة الفصل التربقي. بالمقارنة مع مجموعات OVX ، تم زيادة جزء حجم العظام وعدد التربيق العظمي وسماكة التربيق العظمي في مجموعات علاج بازي بوشن بشكل ملحوظ وانخفضت درجة الفصل التربيقي بشكل ملحوظ.
أشارت نتائج تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين إلى أن الضرر النسيجي في الظنبوب في فقرات L4 للفئران المبيضة قد تم تخفيفه بعد إعطاء بازي بوشن. أظهرت نتائج الكيمياء النسيجية المناعية أنه بالمقارنة مع مجموعات OVX ، أظهرت مجموعات العلاج في Bazi Bushen انخفاضا في التعبير عن RANKL ، وزيادة التعبير عن OPG وتقليل التعبير عن SOST. كما تم تحسين العلامات الكيميائية الحيوية المختلفة لعملية التمثيل الغذائي للعظام في الفئران المبيضة عن طريق علاج بازي بوشن.
تطبيق التصوير المقطعي المحوسب الصغير قابل لإعادة الاستخدام بدرجة كبيرة لأبحاث العظام. هذه التقنية مريحة للغاية لتنوير بنية العظام ويمكن تشغيلها وفقا للخطوة الثالثة.
