Este protocolo pode intuitivamente resultados experimentais, como fenótipo ósseo, indicadores metabólicos e assim por diante. A principal aplicação deste experimento é a micro-CT, que pode realizar uma reconstrução 3D tecidual da análise da morfologia óssea, maior com base em amostras de pele. Para iniciar o procedimento, aplique analgesia local com uma injeção tópica de bupivacaína em um rato devidamente anestesiado.
Em seguida, use uma bola de algodão estéril para desinfetar a área raspada com etanol e iodopovidona três vezes. Usando um bisturi, faça uma incisão na linha média de dois centímetros no abdômen do animal. Exponha o ovário intacto usando uma pinça e ligue na raiz do ovário usando uma sutura cirúrgica 4-0.
Remova o ovário intacto usando uma tesoura cirúrgica antes de suturar a incisão da linha média. Após administração intragástrica da droga por quatro meses e anestesia do animal, corte e descasque a pele da virilha para expor a artéria femoral usando tesoura cirúrgica e pinça. Colete uma amostra de sangue da artéria femoral usando um tubo de coleta de sangue a vácuo.
Em seguida, aplique pressão com uma bola de algodão para parar o sangramento. Continue a cortar e descascar a pele da virilha no membro inferior para expor a tíbia intacta. Remova a tíbia e lave-a três vezes com solução salina.
Usando uma pinça e tesoura oftálmica, remova o excesso de tecido muscular da tíbia colocada em solução salina. Desinfetar a pele posterior da lombar L4 três vezes com etanol e iodopovidona usando uma bola de algodão estéril. Use tesouras cirúrgicas e pinças para cortar a pele das costas e expor a L4 lombar. Corte as vértebras superior e inferior da L4 lombar com um ronguer e corte o sacro ao redor dela com uma tesoura cirúrgica.
Remova o excesso de tecido muscular da L4 lombar lavada colocada em solução salina usando uma pinça e uma microtesoura. Armazene a tíbia e a vértebra L4 em fluido de tecido de formalina a 10% em temperatura ambiente por três dias. Depois de ligar o micro scanner de TC, inicie o software para aquecer a fonte de raios-X.
Crie um banco de dados clicando em criar nova amostra para gerar um arquivo para salvar os dados antes de obter o próximo. Na janela de controle do software, atribua os parâmetros de aquisição de dados. Defina a tensão do tubo de raios X para 50 quilovolts, a corrente do tubo de raios X CT e a corrente do tubo de raios X ao vivo para 100 micro amperes, o campo de visão para 18 milímetros, sem técnica de gating e a técnica de varredura para alta resolução em quatro minutos.
Depois de lavar a tíbia com soro fisiológico três vezes, limpe o excesso de água com papel de filtro. Enrole o tecido da tíbia na cama com filme plástico para fixar sua posição. Ajuste o tecido da tíbia para o centro do campo de imagem girando o botão no instrumento.
Feche a porta do instrumento e ative o modo ao vivo. Pressione o botão de captura para visualizar o tecido tibial. Inicie a varredura clicando no botão de tomografia computadorizada.
Clique em sim para produzir a imagem. Clique em salvar imagem para salvá-la na pasta desejada. Transfira as amostras de tíbia e vértebra L4 previamente armazenadas em solução de formalina a 10% para ácido fórmico a 20% para uma descalcificação de quatro dias.
Após a descalcificação, lave a tíbia e a vértebra L4 colocadas em uma caixa de incorporação com água corrente por mais de seis horas. Desidrate as amostras com soluções de álcool de concentração gradiente em um processador de tecidos automatizado. Coloque as amostras de tecido em xileno por duas horas para torná-las translúcidas.
Em seguida, coloque as amostras permeabalizadas em cera de parafina a 60 graus Celsius por três horas antes de incorporá-las em um processador automático. Obtenha seções de tecido de 4 mícrons usando um cortador rotativo. Coloque as seções na coloração de hematoxilina por três a oito minutos e na coloração de eosina por um a três minutos.
Transfira as seções coradas sequencialmente para álcool puro e xileno. Sele e fixe as seções com goma neutra para view sob um microscópio óptico. Para realizar a recuperação de epítopos induzida por calor nas seções da tíbia, coloque a folha transportadora no tampão de reparo de antígeno apropriado em um recipiente para micro-ondas.
Para reparo de antígeno, coloque o recipiente no micro-ondas por 20 minutos a 98 graus Celsius. Após retirar o recipiente, enxágue o interior com água fria da torneira por 10 minutos. Para bloquear a atividade da peroxidase endógena, incube as fatias da tíbia com peróxido de hidrogênio a 3% por 15 minutos em temperatura ambiente.
Lave as seções em PBS três vezes por cinco minutos cada. Em seguida, incubar as amostras com uma solução de bloqueio do soro de cabra normal numa câmara húmida durante 15 minutos à temperatura ambiente. Adicione 200 microlitros de anticorpos RANKL, osteoprotegerina ou OPG e esclerostina nas amostras de fatia e incube as amostras durante a noite a quatro graus Celsius no escuro.
Em seguida, incube as seções com IgG anti-coelho de cabra marcada com biotina em temperatura ambiente por 30 minutos. Depois de enxaguar com PBS, use diaminobenzidina para corá-los por três a cinco minutos em temperatura ambiente. Tingir as secções com hematoxilina durante um a dois minutos antes de selar as secções desidratadas e secas com goma neutra.
Adicione 25 microlitros de amostra, padrão ou controlada a cada um de seus respectivos poços. Em seguida, adicione 200 microlitros de conjugado HRP de 17 beta-estradiol a cada poço. Cubra todos os poços com papel alumínio e incube a placa a 37 graus Celsius por duas horas.
Depois de remover o líquido de cada poço, lave os poços três vezes com 300 microlitros de solução de lavagem 1X. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução de substrato TMB a cada poço e incuba. Após a incubação, adicione 100 microlitros de solução de parada a cada poço.
Agite suavemente a placa de microtitulação por 30 segundos antes de medir a absorbância da amostra a 450 nanômetros em 30 minutos. As imagens de microtomografia computadorizada reconstruídas da tíbia direita revelaram que as alterações estruturais trabeculares induzidas pela ovariectomia observadas no grupo modelo OVX foram significativamente reduzidas em ratas ovariectomizadas tratadas com a cápsula de Bazi Bushen ou grupo BZBS. Em comparação com o grupo SHAM, o osso trabecular no grupo OVX apresentou uma diminuição significativa na densidade mineral óssea.
Uma tendência semelhante foi observada para a fração de volume ósseo, o número de trabéculas ósseas e a espessura trabecular óssea. Uma tendência oposta foi observada para o grau de separação trabecular. Em comparação com os grupos OVX, a fração de volume ósseo, o número de trabéculas ósseas e a espessura trabecular óssea nos grupos de tratamento Bazi Bushen aumentaram significativamente e o grau de separação trabecular diminuiu acentuadamente.
Os resultados das colorações de hematoxilina e eosina indicaram que o dano histomorfológico na tíbia nas vértebras L4 de ratas ovariectomizadas foi aliviado após a administração de Bazi Bushen. Os resultados da imuno-histoquímica mostraram que, em comparação com os grupos OVX, os grupos de tratamento com Bazi Bushen mostraram uma expressão diminuída de RANKL, aumento da expressão de OPG e redução da expressão de SOST. Vários marcadores bioquímicos do metabolismo ósseo em ratas ovariectomizadas também foram melhorados pelo tratamento com Bazi Bushen.
A aplicação da micro CT é altamente reutilizável para pesquisa óssea. Esta tecnologia é muito conveniente para iluminar a estrutura óssea e pode ser operada de acordo com a etapa três.
