По этому протоколу можно интуитивно подгонять такие экспериментальные результаты, как фенотип кости, метаболические показатели и так далее. Основным применением данного эксперимента является микрокомпьютерная томография, с помощью которой можно выполнить тканевую 3D-реконструкцию морфологического анализа костей, в большей степени на основе образцов кожи. Чтобы начать процедуру, нанесите на правильно обезболенную крысу местное обезболивание с помощью местного введения бупивакаина.
Затем с помощью стерильного ватного тампона трижды продезинфицировать выбритый участок этанолом и повидон-йодом. С помощью скальпеля выполните двухсантиметровый разрез по средней линии на животе животного. Обнажите неповрежденный яичник с помощью щипцов и перевяжите у корня яичника с помощью хирургического шва 4-0.
Удалите неповрежденный яичник с помощью хирургических ножниц перед наложением швов на разрез по средней линии. После внутрижелудочного введения препарата в течение четырех месяцев и обезболивания животного с помощью хирургических ножниц и пинцета разрезают и отшелушивают кожу паха, чтобы обнажить бедренную артерию. Соберите образец крови из бедренной артерии с помощью вакуумной пробирки для сбора крови.
Затем надавите ватным тампоном, чтобы остановить кровотечение. Продолжайте резать и очищать кожу паха в нижней конечности, чтобы обнажить неповрежденную большеберцовую кость. Удалите голень и трижды промойте ее солевым раствором.
С помощью пинцета и офтальмологических ножниц удалите лишнюю мышечную ткань из большеберцовой кости, помещенной в физиологический раствор. Продезинфицируйте заднюю кожу поясничного отдела L4 трижды этанолом и повидон-йодом с помощью стерильного ватного тампона. С помощью хирургических ножниц и пинцета разрежьте кожу задней части и обнажите поясничный отдел L4. Отрежьте верхний и нижний позвонки поясничного отдела L4 с помощью ронгера и отрежьте крестец вокруг него хирургическими ножницами.
Удалите лишнюю мышечную ткань из промытой поясничной L4, помещенной в физиологический раствор, с помощью пинцета и микроножниц. Храните большеберцовую кость и позвонок L4 в тканевой жидкости с содержанием формалина 10% при комнатной температуре в течение трех дней. После включения микрокомпьютерного томографа запустите программное обеспечение для нагрева источника рентгеновского излучения.
Создайте базу данных, нажав на кнопку «Создать новый образец», чтобы сгенерировать файл для сохранения данных перед получением следующего. В окне управления программным обеспечением назначьте параметры сбора данных. Установите напряжение рентгеновской трубки на 50 киловольт, ток рентгеновской трубки КТ и ток рентгеновской трубки под напряжением на 100 микроампер, поле зрения на 18 миллиметров, без метода стробирования, и метод сканирования на высокое разрешение за четыре минуты.
Промыв голень физиологическим раствором три раза, промокните лишнюю воду фильтровальной бумагой. Оберните ткань голени на кровати полиэтиленовой пленкой, чтобы зафиксировать ее положение. Отрегулируйте ткань большеберцовой кости по центру поля визуализации, вращая кнопку в приборе.
Закройте дверцу прибора и включите режим реального времени. Нажмите кнопку захвата, чтобы просмотреть ткани большеберцовой кости. Начните сканирование, нажав кнопку «Компьютерная томография».
Нажмите кнопку «Да», чтобы создать изображение. Нажмите на кнопку Сохранить изображение, чтобы сохранить изображение в нужную папку. Перенесите образцы большеберцовой кости и позвонков L4, ранее хранившиеся в 10% растворе формалина, в 20% раствор муравьиной кислоты для четырехдневной декальцинации.
После декальцинации промойте большеберцовую кость и позвонок L4, помещенные в закладную коробку, проточной водой на более чем шесть часов. Обезвоживайте образцы спиртовыми растворами градиентной концентрации в автоматизированном тканевом процессоре. Поместите образцы тканей в ксилол на два часа, чтобы они стали полупрозрачными.
Затем поместите пропитанные образцы в парафин при температуре 60 градусов Цельсия на три часа, прежде чем погрузить их в автоматический процессор. Получите срезы ткани размером 4 микрона с помощью ротационного слайсера. Поместите срезы в окрашивание гематоксилином на три-восемь минут и окрашивание эозином на одну-три минуты.
Переложите окрашенные участки последовательно в чистый спирт и ксилол. Заклейте и зафиксируйте срезы нейтральной резинкой для просмотра под оптическим микроскопом. Чтобы выполнить индуцированное тепловым извлечение эпитопов на срезах большеберцовой кости, поместите лист-носитель в соответствующий буфер для репарации антигена в контейнере, пригодном для использования в микроволновой печи.
Для восстановления антигена поставьте контейнер в микроволновую печь на 20 минут при температуре 98 градусов Цельсия. Сняв емкость, промойте ее изнутри холодной водой из-под крана в течение 10 минут. Чтобы блокировать активность эндогенной пероксидазы, инкубируйте срезы большеберцовой кости с 3%-ной перекисью водорода в течение 15 минут при комнатной температуре.
Промойте секции в PBS три раза по пять минут каждый. Затем инкубируйте образцы с обычным раствором для блокирования козьей сыворотки во влажной камере в течение 15 минут при комнатной температуре. Добавьте по 200 микролитров антител к RANKL, остеопротегерину или ОПГ и склеростину в образцы среза и инкубируйте образцы в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия в темноте.
Далее инкубируйте секции с меченным биотином козьим антикроличьим IgG при комнатной температуре в течение 30 минут. После полоскания с PBS используйте диаминобензидин для окрашивания в течение трех-пяти минут при комнатной температуре. Покрасьте срезы гематоксилином в течение одной-двух минут, прежде чем запечатать обезвоженные и высушенные срезы нейтральной камедью.
Добавьте по 25 микролитров контролируемого, стандартного или пробного материала в каждую из соответствующих лунок. Затем добавьте в каждую лунку по 200 микролитров конъюгата 17 бета-эстрадиола HRP. Накройте все лунки фольгой и выдержите пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов.
После удаления жидкости из каждой лунки трижды промойте лунки 300 микролитрами моющего раствора 1Х. Затем добавьте в каждую лунку по 100 микролитров раствора субстрата ТМБ и инкубируйте. После инкубации добавьте в каждую лунку по 100 микролитров стоп-раствора.
Осторожно встряхните пластину с микротитром в течение 30 секунд, прежде чем измерить поглощение образца на 450 нанометрах в течение 30 минут. Реконструированные микрокомпьютерные томографические изображения правой большеберцовой кости показали, что вызванные овариоэктомией трабекулярные структурные изменения, наблюдаемые в модельной группе OVX, были значительно снижены у овариэктомированных крыс, получавших капсулу Бази Бушен или группу BZBS. По сравнению с группой SHAM, трабекулярная кость в группе OVX показала значительное снижение минеральной плотности кости.
Аналогичная тенденция наблюдалась в отношении объемной доли кости, количества костных трабекул и толщины костного трабекуляра. Противоположная тенденция наблюдалась для степени трабекулярного разделения. По сравнению с группами OVX объемная фракция кости, количество трабекул кости и толщина трабекулярной кости в группах лечения Бацзы Бушен были достоверно увеличены, а степень трабекулярного разделения заметно снижена.
Результаты окрашивания гематоксилином и эозином показали, что гистоморфологическое повреждение большеберцовой кости в позвонках L4 овариэктомированных крыс было уменьшено после введения Бази Бушена. Результаты иммуногистохимии показали, что по сравнению с группами OVX, в группах лечения в Бази-Бушене наблюдалось снижение экспрессии RANKL, увеличение экспрессии ОПГ и снижение экспрессии SOST. Различные биохимические маркеры костного метаболизма у овариэктомированных крыс также были улучшены с помощью лечения Бази Бушена.
Применение микрокомпьютерной томографии имеет высокую степень многоразового использования для исследования костей. Эта технология очень удобна для просветления костной структуры и может работать по третьему шагу.
