このプロトコールは、骨の表現型、代謝指標などの結果を直感的に実験することができます。この実験の主な用途は、骨の形態分析の組織3D再構成を行うことができるマイクロCTであり、皮膚サンプルに基づいて大きくなります。手順を開始するには、適切に麻酔されたラットにブピバカインの局所注射で局所鎮痛を適用します。.
次に、滅菌コットンボールを使用して、剃った部分をエタノールとポビドンヨードで3回消毒します。メスを使用して、動物の腹部に2センチメートルの正中線切開を行います。鉗子を使用して無傷の卵巣を露出させ、4-0外科用縫合糸を使用して卵巣の根元で結紮します。
正中線切開部を縫合する前に、手術用ハサミを使用して無傷の卵巣を取り出します。4ヶ月間胃内に投与し、動物に麻酔をかけた後、鼠径部の皮膚を切開して剥離し、手術用ハサミとピンセットを使用して大腿動脈を露出させます。真空採血管を使用して大腿動脈から血液サンプルを採取します。
次に、綿球で圧力をかけて出血を止めます。下肢の鼠径部の皮膚を切って剥がし続け、無傷の脛骨を露出させます。脛骨を取り外し、生理食塩水で3回洗います。
ピンセットと眼科用ハサミを使用して、生理食塩水に入れられた脛骨から余分な筋肉組織を取り除きます。滅菌コットンボールを使用して、腰椎L4の背中の皮膚をエタノールとポビドンヨードで3回消毒します。.手術用ハサミとピンセットを使用して背中の皮膚を切り取り、腰椎L4を露出させます。腰椎L4の上部と下部の椎骨をロンゲルで切断し、手術用ハサミでその周りの仙骨を切り取ります。
ピンセットとマイクロハサミを使用して、生理食塩水に入れた洗浄した腰椎L4から余分な筋肉組織を取り除きます。脛骨とL4椎骨を10%ホルマリン組織液に室温で3日間保存します。マイクロCTスキャナーの電源を入れた後、X線源を加熱するソフトウェアを起動します。
「新しいサンプルを作成」をクリックしてデータベースを作成し、次のサンプルを取得する前にデータを保存するファイルを生成します。ソフトウェア制御ウィンドウで、データ集録パラメータを割り当てます。X線管の電圧を50キロボルトに、CTのX線管電流と生のX線管電流を100マイクロアンペアに、視野を18ミリメートルに設定し、ゲート技術を使わず、スキャン技術を4分で高解像度に設定します。
生理食塩水で脛骨を3回洗った後、濾紙で余分な水分を拭き取ります。ベッドの上の脛骨ティッシュをプラスチックフィルムで包み、その位置を固定します。装置のボタンを回転させて、脛骨組織をイメージングフィールドの中心に調整します。
楽器のドアを閉じて、ライブモードをオンにします。キャプチャボタンを押して view 脛骨組織。CTスキャンボタンをクリックしてスキャンを開始します。
[はい] をクリックして画像を生成します。[画像の保存]をクリックして、画像を目的のフォルダに保存します。以前に 10% ホルマリンに保存した脛骨と L4 椎骨のサンプルを 20% ホルマリン溶液に移し、4 日間の脱灰を行います。
脱灰後、脛骨とL4椎骨を埋め込みボックスに入れ、流水で6時間以上洗浄します。自動組織処理装置でグラジエント濃度アルコール溶液でサンプルを脱水します。組織標本をキシレンに2時間置いて半透明にします。
次に、透過処理したサンプルを60°Cのパラフィンワックスに3時間入れてから、自動処理装置に埋め込みます。ロータリースライサーを使用して4ミクロンの組織切片を取得します。切片をヘマトキシリン染色液に3〜8分間、エオシン染色液に1〜3分間置く。
染色した切片を順番に純アルコールとキシレンに移します。切片を中性ガムで密封して固定し、光学顕微鏡で観察します。脛骨切片で熱誘起エピトープ賦活化を行うには、キャリアシートを電子レンジ対応容器内の適切な抗原修復バッファーに入れます。
抗原修復のためには、容器を98°Cで20分間電子レンジで加熱します。容器を取り出した後、内部を冷たい水道水で10分間洗い流してください。内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックするには、脛骨スライスを3%過酸化水素と室温で15分間インキュベートします。
PBSで切片を3回、それぞれ5分間洗浄します。次に、サンプルを通常のヤギ血清ブロッキング溶液と湿ったチャンバー内で室温で15分間インキュベートします。スライスサンプルにRANKL、オステオプロテゲリン、OPG、スクレロスチン抗体をそれぞれ200マイクロリットル加え、暗所で4°Cで一晩インキュベートします。
次に、ビオチン標識ヤギ抗ウサギIgGと切片を室温で30分間インキュベートします。PBSですすいだ後、ジアミノベンジジンを使用して室温で3〜5分間染色します。切片をヘマトキシリンで1〜2分間染色してから、脱水および乾燥した切片を中性ガムで密封します。
25マイクロリットルの制御済み、標準、またはサンプルをそれぞれのウェルに加えます。次に、200マイクロリットルの17個のβ-エストラジオールHRPコンジュゲートを各ウェルに加えます。すべてのウェルをホイルで覆い、プレートを摂氏37度で2時間インキュベートします。
各ウェルから液体を取り除いた後、300マイクロリットルの1X洗浄液でウェルを3回洗浄します。次に、100マイクロリットルのTMB基質溶液を各ウェルに加え、インキュベートします。インキュベーション後、各ウェルに100マイクロリットルの停止溶液を加えます。
マイクロタイタープレートを30秒間静かに振ってから、30分以内に450ナノメートルでサンプルの吸光度を測定します。右脛骨の再構成マイクロCT画像から、モデルOVX群で見られた卵巣摘出術による海綿骨構造変化は、Bazi BushenカプセルまたはBZBS群で治療された卵巣摘出ラットで有意に減少したことが明らかになりました。SHAM群と比較して、OVX群の海綿骨は骨密度の有意な減少を示しました。
同様の傾向は、骨体積分率、骨小柱の数、および骨小柱の厚さについても見られました。小柱分離度では逆の傾向が見られました。OVX群と比較して、Bazi Bushen治療群の骨容積分率、骨小柱の数、骨小柱の厚さは有意に増加し、小柱分離度は著しく減少しました。
ヘマトキシリンとエオシンの染色結果は、卵巣摘出ラットのL4椎骨の脛骨の組織形態学的損傷がBazi Bushen投与後に緩和されたことを示しました。免疫組織化学の結果は、OVXグループと比較して、Bazi Bushen治療グループがRANKLの発現減少、OPGの発現増加、およびSOSTの発現減少を示したことを示しました。卵巣摘出ラットの骨代謝のさまざまな生化学的マーカーも、Bazi Bushen治療によって改善されました。
マイクロCTの応用は、骨研究に非常に再利用可能です。この技術は、骨の構造を啓発するのに非常に便利で、ステップ3に従って操作できます。
