Este protocolo puede experimentar intuitivamente resultados como el fenotipo óseo, indicadores metabólicos, etc. La principal aplicación de este experimento es la micro-TAC, que permite realizar una reconstrucción tisular en 3D del análisis de la morfología ósea, en mayor medida a partir de muestras de piel. Para comenzar el procedimiento, aplique analgesia local con una inyección tópica de bupivacaína en una rata debidamente anestesiada.
A continuación, utilice una bola de algodón estéril para desinfectar la zona afeitada con etanol y povidona yodada tres veces. Con un bisturí, realice una incisión de dos centímetros en la línea media del abdomen del animal. Exponga el ovario intacto con fórceps y lige en la raíz del ovario con una sutura quirúrgica 4-0.
Extirpe el ovario intacto con unas tijeras quirúrgicas antes de suturar la incisión de la línea media. Después de administrar el fármaco por vía intragástrica durante cuatro meses y anestesiar al animal, corte y pele la piel de la ingle para exponer la arteria femoral con tijeras quirúrgicas y pinzas. Recolectar una muestra de sangre de la arteria femoral usando un tubo de recolección de sangre al vacío.
Luego aplique presión con una bola de algodón para detener el sangrado. Continúe cortando y pelando la piel de la ingle en la extremidad inferior para exponer la tibia intacta. Retira la tibia y lávala tres veces con solución salina.
Con pinzas y tijeras oftálmicas, retire el exceso de tejido muscular de la tibia colocado en solución salina. Desinfecte la piel posterior de la L4 lumbar tres veces con etanol y povidona yodada utilizando una bola de algodón estéril. Use tijeras quirúrgicas y pinzas para cortar la piel de la espalda y exponer la L4 lumbar. Cortar las vértebras superior e inferior de la L4 lumbar con un ronguer y cortar el sacro que la rodea con unas tijeras quirúrgicas.
Eliminar el exceso de tejido muscular de la L4 lumbar lavada colocada en solución salina con pinzas y microtijeras. Almacene la tibia y la vértebra L4 en líquido tisular con formalina al 10% a temperatura ambiente durante tres días. Después de encender el escáner de micro tomografía computarizada, inicie el software para calentar la fuente de rayos X.
Cree una base de datos haciendo clic en crear nueva muestra para generar un archivo para guardar los datos antes de obtener el siguiente. En la ventana de control del software, asigne los parámetros de adquisición de datos. Establezca el voltaje del tubo de rayos X en 50 kilovoltios, la corriente del tubo de rayos X CT y la corriente del tubo de rayos X en vivo en 100 microamperios, el campo de visión en 18 milímetros, sin técnica de compuerta y la técnica de escaneo a alta resolución en cuatro minutos.
Después de lavar la tibia con solución salina tres veces, seca el exceso de agua con papel de filtro. Envuelva el tejido de la tibia en la cama con una película de plástico para fijar su posición. Ajuste el tejido de la tibia al centro del campo de imágenes girando el botón del instrumento.
Cierre la puerta del instrumento y active el modo en vivo. Presione el botón de captura para ver el tejido tibial. Inicie la exploración haciendo clic en el botón de tomografía computarizada.
Haga clic en Sí para producir la imagen. Haga clic en guardar imagen para guardar la imagen en la carpeta deseada. Transfiera las muestras de tibia y vértebra L4 previamente almacenadas en una solución de formalina al 10% por ácido fórmico al 20% para una descalcificación de cuatro días.
Después de la descalcificación, lavar la tibia y la vértebra L4 colocadas en una caja de inclusión con agua corriente durante más de seis horas. Deshidrate las muestras con soluciones de alcohol de concentración de gradiente en un procesador de tejidos automatizado. Coloque las muestras de tejido en xileno durante dos horas para que queden translúcidas.
A continuación, coloque las muestras permeabalizadas en cera de parafina a 60 grados centígrados durante tres horas antes de incrustarlas en un procesador automático. Obtenga secciones de tejido de 4 micras utilizando una cortadora rotativa. Coloque las secciones en la tinción de hematoxilina durante tres a ocho minutos y la tinción de eosina durante uno a tres minutos.
Transfiera las secciones manchadas secuencialmente a alcohol puro y xileno. Selle y fije las secciones con goma neutra para verlas bajo un microscopio óptico. Para realizar la recuperación de epítopos inducida por calor en las secciones de la tibia, coloque la lámina portadora en el tampón de reparación de antígeno apropiado en un recipiente apto para microondas.
Para la reparación del antígeno, calienta el recipiente en el microondas durante 20 minutos a 98 grados centígrados. Después de retirar el recipiente, enjuague su interior con agua fría del grifo durante 10 minutos. Para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena, incubar las rodajas de tibia con peróxido de hidrógeno al 3% durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Lave las secciones en PBS tres veces durante cinco minutos cada una. A continuación, incubar las muestras con una solución bloqueadora normal de suero de cabra en una cámara húmeda durante 15 minutos a temperatura ambiente. Agregue 200 microlitros de anticuerpos RANKL, osteoprotegerina u OPG y esclerostina en las muestras de corte, e incube las muestras durante la noche a cuatro grados Celsius en la oscuridad.
A continuación, incube las secciones con IgG anti-conejo de cabra marcada con biotina a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de enjuagar los con PBS, use diaminobenzidina para teñirlos durante tres a cinco minutos a temperatura ambiente. Teñir las secciones con hematoxilina durante uno o dos minutos antes de sellar las secciones deshidratadas y secas con goma neutra.
Agregue 25 microlitros de muestra controlada, estándar o muestra a cada uno de sus pocillos respectivos. A continuación, añada 200 microlitros de 17 conjugado de beta-estradiol HRP a cada pocillo. Cubra todos los pocillos con papel de aluminio e incube la placa a 37 grados centígrados durante dos horas.
Después de eliminar el líquido de cada pocillo, lave los pocillos tres veces con 300 microlitros de solución de lavado 1X. A continuación, añadir 100 microlitros de solución de sustrato de TMB a cada pocillo e incubar. Después de la incubación, agregue 100 microlitros de solución de parada a cada pocillo.
Agite suavemente la placa de microtitulación durante 30 segundos antes de medir la absorbancia de la muestra a 450 nanómetros en 30 minutos. Las imágenes de microtomografía computarizada reconstruidas de la tibia derecha revelaron que los cambios estructurales trabeculares inducidos por la ovariectomía observados en el grupo modelo OVX se redujeron significativamente en las ratas ovariectomizadas tratadas con la cápsula Bazi Bushen o el grupo BZBS. En comparación con el grupo SHAM, el hueso trabecular en el grupo OVX mostró una disminución significativa en la densidad mineral ósea.
Se observó una tendencia similar para la fracción de volumen óseo, el número de trabéculas óseas y el grosor trabecular óseo. Se observó una tendencia opuesta para el grado de separación trabecular. En comparación con los grupos OVX, la fracción de volumen óseo, el número de trabéculas óseas y el grosor trabecular óseo en los grupos de tratamiento con Bazi Bushen aumentaron significativamente y el grado de separación trabecular disminuyó notablemente.
Los resultados de la tinción con hematoxilina y eosina indicaron que el daño histomorfológico en la tibia en las vértebras L4 de ratas ovariectomizadas se alivió después de la administración de Bazi Bushen. Los resultados de inmunohistoquímica mostraron que, en comparación con los grupos de OVX, los grupos de tratamiento con Bazi Bushen mostraron una disminución de la expresión de RANKL, un aumento de la expresión de OPG y una reducción de la expresión de SOST. Varios marcadores bioquímicos del metabolismo óseo en ratas ovariectomizadas también mejoraron con el tratamiento con Bazi Bushen.
La aplicación de micro CT es altamente reutilizable para la investigación ósea. Esta tecnología es muy conveniente para iluminar la estructura ósea y se puede operar de acuerdo con el paso tres.
