Ce protocole peut intuitivement expérimenter des résultats tels que le phénotype osseux, les indicateurs métaboliques, etc. L’application principale de cette expérience est la micro-tomodensitométrie, qui permet d’effectuer une reconstruction tissulaire 3D de l’analyse de la morphologie osseuse, plus importante sur la base d’échantillons de peau. Pour commencer la procédure, appliquez une analgésie locale avec une injection topique de bupivacaïne sur un rat correctement anesthésié.
Ensuite, utilisez une boule de coton stérile pour désinfecter la zone rasée avec de l’éthanol et de la povidone iodée trois fois. À l’aide d’un scalpel, effectuez une incision médiane de deux centimètres sur l’abdomen de l’animal. Exposez l’ovaire intact à l’aide d’une pince et ligaturez la racine de l’ovaire à l’aide d’une suture chirurgicale 4-0.
Retirez l’ovaire intact à l’aide de ciseaux chirurgicaux avant de suturer l’incision médiane. Après avoir administré le médicament par voie intragastrique pendant quatre mois et anesthésié l’animal, coupez et pelez la peau de l’aine pour exposer l’artère fémorale à l’aide de ciseaux chirurgicaux et d’une pince à épiler. Prélever un échantillon de sang dans l’artère fémorale à l’aide d’un tube de prélèvement sanguin sous vide.
Appliquez ensuite une pression avec une boule de coton pour arrêter le saignement. Continuez à couper et à peler la peau de l’aine dans le membre inférieur pour exposer le tibia intact. Retirez le tibia et lavez-le trois fois avec une solution saline.
À l’aide d’une pince à épiler et de ciseaux ophtalmiques, retirez l’excès de tissu musculaire du tibia placé dans une solution saline. Désinfectez la peau dorsale de la L4 lombaire trois fois avec de l’éthanol et de la povidone iodée à l’aide d’un coton stérile. Utilisez des ciseaux chirurgicaux et une pince à épiler pour couper la peau du dos et exposer la L4 lombaire. Sectionnez les vertèbres supérieures et inférieures de la L4 lombaire avec un ronguer et coupez le sacrum qui l’entoure avec des ciseaux chirurgicaux.
Retirez l’excès de tissu musculaire de la L4 lombaire lavée placée dans une solution saline à l’aide d’une pince à épiler et de micro-ciseaux. Conservez le tibia et la vertèbre L4 dans du liquide tissulaire à 10 % de formol à température ambiante pendant trois jours. Après avoir allumé le scanner micro-tomodensitomètre, démarrez le logiciel pour chauffer la source de rayons X.
Créez une base de données en cliquant sur créer un nouvel échantillon pour générer un fichier permettant de sauvegarder les données avant d’obtenir le suivant. Dans la fenêtre de contrôle du logiciel, attribuez les paramètres d’acquisition de données. Réglez la tension du tube à rayons X à 50 kilovolts, le courant du tube à rayons X CT et le courant du tube à rayons X sous tension à 100 microampères, le champ de vision à 18 millimètres, pas de technique de déclenchement et la technique de balayage à haute résolution en quatre minutes.
Après avoir lavé le tibia avec une solution saline trois fois, épongez l’excès d’eau avec du papier filtre. Enroulez le tissu du tibia sur le lit avec un film plastique pour fixer sa position. Ajustez le tissu tibial au centre du champ d’imagerie en tournant le bouton de l’instrument.
Fermez la porte de l’instrument et activez le mode live. Appuyez sur le bouton de capture pour voir le tissu tibial. Démarrez l’examen en cliquant sur le bouton CT scan.
Cliquez sur oui pour produire l’image. Cliquez sur l’enregistrement de l’image pour enregistrer l’image dans le dossier souhaité. Transférez les échantillons de vertèbres tibia et L4 précédemment stockés dans une solution d’acide formique à 10 % de formol pour une décalcification de quatre jours.
Après la décalcification, lavez le tibia et la vertèbre L4 placés dans une boîte d’enrobage avec de l’eau courante pendant plus de six heures. Déshydratez les échantillons avec des solutions d’alcool à gradient de concentration dans un processeur de tissus automatisé. Placez les échantillons de tissu dans du xylène pendant deux heures pour les rendre translucides.
Placez ensuite les échantillons perméabalisés dans de la cire de paraffine à 60 degrés Celsius pendant trois heures avant de les intégrer dans un processeur automatique. Obtenez des sections de tissu de 4 microns à l’aide d’une trancheuse rotative. Placez les sections dans la coloration à l’hématoxyline pendant trois à huit minutes et la coloration à l’éosine pendant une à trois minutes.
Transférez séquentiellement les sections tachées dans de l’alcool pur et du xylène. Scellez et fixez les sections avec de la gomme neutre pour les visualiser au microscope optique. Pour effectuer la récupération d’épitopes induite par la chaleur sur les sections du tibia, placez la feuille de support dans le tampon de réparation d’antigène approprié dans un récipient allant au micro-ondes.
Pour la réparation de l’antigène, passez le récipient au micro-ondes pendant 20 minutes à 98 degrés Celsius. Après avoir retiré le récipient, rincez son intérieur à l’eau froide du robinet pendant 10 minutes. Pour bloquer l’activité endogène de la peroxydase, incubez les tranches de tibia avec 3 % de peroxyde d’hydrogène pendant 15 minutes à température ambiante.
Lavez les sections dans PBS trois fois pendant cinq minutes chacune. Ensuite, incubez les échantillons avec une solution normale de blocage du sérum de chèvre dans une chambre humide pendant 15 minutes à température ambiante. Ajoutez 200 microlitres d’anticorps RANKL, d’ostéotétratérine ou OPG et d’anticorps anti-sclérostine dans les échantillons de tranches, et incubez les échantillons pendant la nuit à quatre degrés Celsius dans l’obscurité.
Ensuite, incubez les sections avec des IgG de chèvre anti-lapin marquées à la biotine à température ambiante pendant 30 minutes. Après avoir rincé le avec du PBS, utilisez de la diaminobenzidine pour les colorer pendant trois à cinq minutes à température ambiante. Teignez les sections avec de l’hématoxyline pendant une à deux minutes avant de sceller les sections déshydratées et séchées avec de la gomme neutre.
Ajoutez 25 microlitres de puits contrôlés, standard ou d’échantillon dans chacun de leurs puits respectifs. Ajoutez ensuite 200 microlitres de 17 conjugués de bêta-œstradiol HRP dans chaque puits. Couvrez tous les puits de papier d’aluminium et incubez l’assiette à 37 degrés Celsius pendant deux heures.
Après avoir retiré le liquide de chaque puits, lavez les puits trois fois avec 300 microlitres de solution de lavage 1X. Ajoutez ensuite 100 microlitres de solution de substrat TMB dans chaque puits et incuber. Après l’incubation, ajoutez 100 microlitres de solution d’arrêt dans chaque puits.
Agitez doucement la plaque de microtitration pendant 30 secondes avant de mesurer l’absorbance de l’échantillon à 450 nanomètres en 30 minutes. Les images micro-tomodensitométriques reconstruites du tibia droit ont révélé que les changements structurels trabéculaires induits par l’ovariectomie observés dans le groupe OVX modèle étaient significativement réduits chez les rats ovariectomisés traités avec la capsule Bazi Bushen ou le groupe BZBS. Par rapport au groupe YAMA, l’os trabéculaire du groupe OVX a montré une diminution significative de la densité minérale osseuse.
Une tendance similaire a été observée pour la fraction volumique osseuse, le nombre de trabécules osseuses et l’épaisseur de la trabéculaire osseuse. Une tendance inverse a été observée pour le degré de séparation trabéculaire. Par rapport aux groupes OVX, la fraction du volume osseux, le nombre de trabécules osseuses et l’épaisseur trabéculaire osseuse dans les groupes traités par Bazi Bushen ont été significativement augmentés et le degré de séparation trabéculaire a été nettement diminué.
Les résultats de la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine ont indiqué que les dommages histomorphologiques dans le tibia des vertèbres L4 des rats ovariectomisés ont été soulagés après l’administration de Bazi Bushen. Les résultats de l’immunohistochimie ont montré que, par rapport aux groupes OVX, les groupes traités par Bazi Bushen présentaient une diminution de l’expression de RANKL, une augmentation de l’expression de l’OPG et une réduction de l’expression de SOST. Divers marqueurs biochimiques du métabolisme osseux chez les rats ovariectomisés ont également été améliorés par le traitement de Bazi Bushen.
L’application de la micro-tomodensitométrie est hautement réutilisable pour la recherche osseuse. Cette technologie est très pratique pour éclairer la structure osseuse et peut être utilisée selon la troisième étape.
