이 프로토콜은 뼈 표현형, 대사 지표 등과 같은 결과를 직관적으로 실험할 수 있습니다. 이 실험의 주요 응용 프로그램은 뼈 형태 분석의 조직 3D 재구성을 수행할 수 있는 마이크로 CT이며, 피부 샘플을 기반으로 하여 더 큽니다. 절차를 시작하려면 적절하게 마취된 쥐에게 bupivacaine의 국소 주사로 국소 진통제를 적용합니다.
그런 다음 멸균 면봉을 사용하여 면도 부위를 에탄올과 포비돈 요오드로 세 번 소독합니다. 메스를 사용하여 동물의 복부에 2cm 정중선을 절개합니다. 겸자를 사용하여 온전한 난소를 노출시키고 4-0 수술용 봉합사를 사용하여 난소 뿌리에 결찰합니다.
정중선 절개 부위를 봉합하기 전에 수술용 가위를 사용하여 손상되지 않은 난소를 제거합니다. 4개월 동안 약물을 위장 내 투여하고 동물을 마취한 후 수술용 가위와 핀셋을 사용하여 사타구니의 피부를 자르고 벗겨내어 대퇴 동맥을 노출시킵니다. 진공 혈액 수집 튜브를 사용하여 대퇴 동맥에서 혈액 샘플을 수집합니다.
그런 다음 출혈을 멈추기 위해 면봉으로 압력을 가합니다. 하지의 사타구니 피부를 계속 자르고 벗겨내어 손상되지 않은 경골을 노출시킵니다. 경골을 제거하고 식염수로 세 번 씻는다.
핀셋과 안과 가위를 사용하여 식염수에 놓인 경골에서 과도한 근육 조직을 제거합니다. 멸균 면봉을 사용하여 에탄올과 포비돈 요오드로 요추 L4의 뒷 피부를 세 번 소독합니다. 수술용 가위와 핀셋을 사용하여 뒤쪽 피부를 자르고 요추 L4를 노출시킵니다. 요추 L4의 상부 및 하부 척추를 롱게르로 절단하고 그 주위의 천골을 수술용 가위로 잘라냅니다.
핀셋과 마이크로 가위를 사용하여 식염수에 넣은 세척된 요추 L4에서 과도한 근육 조직을 제거합니다. 경골과 L4 척추를 10% 포르말린 조직액에 넣어 실온에서 3일 동안 보관합니다. 마이크로 CT 스캐너를 켠 후 소프트웨어를 시작하여 X선 소스를 가열합니다.
새 샘플 만들기를 클릭하여 데이터베이스를 만들고 다음 샘플을 얻기 전에 데이터를 저장할 파일을 생성합니다. 소프트웨어 제어 창에서 데이터 수집 파라미터를 할당합니다. X선관 전압을 50킬로볼트로, CT X선관 전류 및 라이브 X선관 전류를 100마이크로암페어로, 시야를 18mm로 설정하고, 게이팅 기술을 사용하지 않고, 스캐닝 기술을 4분 안에 고해상도로 설정합니다.
경골을 식염수로 세 번 씻은 후 여과지로 여분의 물을 닦아내십시오. 침대의 경골 조직을 플라스틱 필름으로 감싸 위치를 고정합니다. 기기의 버튼을 돌려 경골 조직을 이미징 필드의 중앙으로 조정합니다.
악기 도어를 닫고 라이브 모드를 켭니다. 캡처 버튼을 눌러 view 경골 조직. CT 스캔 버튼을 클릭하여 스캔을 시작합니다.
예를 클릭하여 이미지를 생성합니다. 이미지 저장을 클릭하여 원하는 폴더에 이미지를 저장합니다. 4일간의 석회질 제거를 위해 이전에 10% 포르말린에 보관했던 경골 및 L4 척추 샘플을 20% 포름산 용액으로 옮깁니다.
석회질 제거 후 임베딩 박스에 넣은 경골과 L4 척추를 흐르는 물로 6시간 이상 세척합니다. 자동 조직 처리기에서 그래디언트 농도 알코올 용액으로 샘플을 탈수합니다. 조직 표본을 크실렌에 2시간 동안 넣어 반투명하게 만듭니다.
그런 다음 투과된 샘플을 섭씨 60도의 파라핀 왁스에 3시간 동안 두었다가 자동 프로세서에 삽입합니다. 회전식 슬라이서를 사용하여 4미크론 조직 절편을 얻습니다. 헤마톡실린 염색제에 절편을 3-8분 동안 두고, 에오신 염색제를 1-3분 동안 놓습니다.
염색된 부분을 순차적으로 순수한 알코올과 크실렌으로 옮깁니다. 중성 검으로 섹션을 밀봉하고 고정하여 광학 현미경으로 볼 수 있습니다. 경골 절편에서 열 유도 에피토프 검색을 수행하려면 캐리어 시트를 전자레인지용 용기의 적절한 항원 복구 버퍼에 넣습니다.
항원 복구를 위해 용기를 섭씨 98도에서 20분 동안 전자레인지에 돌립니다. 용기를 제거한 후 차가운 수돗물로 내부를 10분 동안 헹굽니다. 내인성 과산화효소 활성을 차단하려면 경골 절편을 3% 과산화수소로 실온에서 15분 동안 배양합니다.
PBS의 섹션을 각각 5분씩 세 번 세척합니다. 그런 다음 일반 염소 혈청 차단 용액과 함께 샘플을 습한 챔버에서 실온에서 15분 동안 배양합니다. RANKL, 오스테오프로테게린 또는 OPG 및 스클레로스틴 항체 각각 200마이크로리터를 슬라이스 샘플에 추가하고 어두운 곳에서 섭씨 4도에서 밤새 샘플을 배양합니다.
다음으로, 실온에서 30분 동안 비오틴 표지 염소 항-토끼 IgG로 절편을 배양합니다. PBS로 헹군 후 디아미노벤지딘을 사용하여 실온에서 3-5분 동안 염색합니다. 1-2분 동안 헤마톡실린으로 단면을 염색한 후 탈수되고 건조된 단면을 중성 검으로 밀봉합니다.
25 마이크로리터의 제어, 표준 또는 샘플을 각각의 웰에 추가합니다. 그런 다음 각 웰에 200마이크로리터의 17 베타-에스트라디올 HRP 접합체를 추가합니다. 모든 우물을 호일로 덮고 접시를 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다.
각 웰에서 액체를 제거한 후 300마이크로리터의 1X 세척 용액으로 웰을 세 번 세척합니다. 그런 다음 100 마이크로 리터의 TMB 기질 용액을 각 웰에 추가하고 배양합니다. 배양 후 각 웰에 100마이크로리터의 정지 용액을 추가합니다.
마이크로 역가 플레이트를 30초 동안 부드럽게 흔든 후 30분 이내에 450나노미터에서 샘플의 흡광도를 측정합니다. 오른쪽 경골의 복원된 마이크로 CT 이미지는 모델 OVX 그룹에서 관찰된 난소 절제술에 의한 섬유주 구조 변화가 Bazi Bushen 캡슐 또는 BZBS 그룹으로 치료된 난소 절제술 쥐에서 유의하게 감소했음을 보여주었습니다. SHAM 그룹과 비교했을 때, OVX 그룹의 섬유주 뼈는 골밀도가 유의하게 감소한 것으로 나타났다.
뼈 부피 분율(bone volume fraction), 뼈 섬유주(bone trabeculae)의 수, 뼈 섬유주 두께(bone trabecular thickness)에서도 유사한 경향을 보였다. 섬유주 분리 정도에 대해서는 반대의 경향을 보였다. OVX 투여군과 비교했을 때, Bazi Bushen 치료군에서 골용적률, 골섬유주 수 및 골섬유주 두께가 유의하게 증가하였고, 섬유주 분리도는 현저히 감소하였다.
헤마톡실린 및 에오신 염색 결과는 난소 절제술을 받은 쥐의 L4 척추뼈에서 경골의 조직형태학적 손상이 Bazi Bushen을 투여한 후 완화되었음을 나타냈습니다. 면역조직화학 결과, OVX 투여군에 비해 Bazi Bushen 치료군은 RANKL의 발현이 감소하고, OPG의 발현이 증가하며, SOST의 발현이 감소하는 것으로 나타났다. 난소 절제술을 받은 쥐의 뼈 대사에 대한 다양한 생화학적 마커도 Bazi Bushen 처리에 의해 개선되었습니다.
마이크로 CT의 적용은 뼈 연구에 재사용이 가능합니다. 이 기술은 뼈 구조를 밝히는 데 매우 편리하며 3단계에 따라 작동할 수 있습니다.
