Dieses Protokoll kann intuitiv Ergebnisse wie Knochenphänotyp, Stoffwechselindikatoren usw. experimentieren. Die Hauptanwendung dieses Experiments ist die Mikro-CT, mit der eine 3D-Rekonstruktion der Knochenmorphologie-Analyse des Gewebes durchgeführt werden kann, die auf der Grundlage von Hautproben durchgeführt werden kann. Um den Eingriff zu beginnen, wenden Sie eine lokale Analgesie mit einer topischen Injektion von Bupivacain auf eine ordnungsgemäß anästhesierte Ratte an.
Desinfizieren Sie dann die rasierte Stelle mit einem sterilen Wattebausch dreimal mit Ethanol und Povidon-Jod. Führen Sie mit einem Skalpell einen zwei Zentimeter langen Schnitt in der Mittellinie am Bauch des Tieres durch. Legen Sie den intakten Eierstock mit einer Pinzette frei und ligatieren Sie an der Wurzel des Eierstocks mit einer chirurgischen 4-0-Naht.
Entfernen Sie den intakten Eierstock mit einer chirurgischen Schere, bevor Sie den Mittellinienschnitt nähen. Nachdem Sie das Medikament vier Monate lang intragastrisch verabreicht und das Tier betäubt haben, schneiden und schälen Sie die Haut der Leiste, um die Oberschenkelarterie mit einer chirurgischen Schere und Pinzette freizulegen. Entnehmen Sie eine Blutprobe aus der Oberschenkelarterie mit einem Vakuum-Blutentnahmeröhrchen.
Üben Sie dann mit einem Wattebausch Druck aus, um die Blutung zu stoppen. Fahren Sie fort, die Haut der Leiste in der unteren Extremität zu schneiden und zu schälen, um das intakte Schienbein freizulegen. Entfernen Sie das Schienbein und waschen Sie es dreimal mit Kochsalzlösung.
Entfernen Sie mit einer Pinzette und einer Augenschere überschüssiges Muskelgewebe aus dem Schienbein, das in Kochsalzlösung gelegt wird. Desinfizieren Sie die hintere Haut des L4 L4 dreimal mit Ethanol und Povidon-Jod mit einem sterilen Wattebausch. Verwenden Sie eine chirurgische Schere und Pinzette, um die Rückenhaut zu schneiden und die Lendenwirbelsäule L4 freizulegen. Trennen Sie den oberen und unteren Wirbel der L4 L4 mit einem Ronguer und schneiden Sie das Kreuzbein um ihn herum mit einer chirurgischen Schere ab.
Entfernen Sie überschüssiges Muskelgewebe aus dem gewaschenen L4 der Lendenwirbelsäule, das in Kochsalzlösung gelegt wurde, mit einer Pinzette und einer Mikroschere. Lagern Sie das Schienbein und den L4-Wirbel drei Tage lang in 10%iger Formalin-Gewebsflüssigkeit bei Raumtemperatur. Starten Sie nach dem Einschalten des Mikro-CT-Scanners die Software, um die Röntgenquelle zu erwärmen.
Erstellen Sie eine Datenbank, indem Sie auf Neues Beispiel erstellen klicken, um eine Datei zu generieren, in der die Daten gespeichert werden, bevor Sie die nächste Datei abrufen. Weisen Sie im Fenster der Softwaresteuerung die Datenerfassungsparameter zu. Stellen Sie die Spannung der Röntgenröhre auf 50 Kilovolt, den Strom der CT-Röntgenröhre und den Strom der Live-Röntgenröhre auf 100 Mikroampere, das Sichtfeld auf 18 Millimeter, keine Gating-Technik und die Scantechnik auf hohe Auflösung in vier Minuten ein.
Nachdem Sie das Schienbein dreimal mit Kochsalzlösung gewaschen haben, tupfen Sie überschüssiges Wasser mit Filterpapier ab. Wickeln Sie das Tibiagewebe mit Plastikfolie auf das Bett, um seine Position zu fixieren. Stellen Sie das Tibiagewebe durch Drehen der Taste am Instrument auf die Mitte des Bildgebungsfeldes ein.
Schließen Sie die Instrumententür und schalten Sie den Live-Modus ein. Drücken Sie die Aufnahmetaste, um das Tibiagewebe anzuzeigen. Starten Sie den Scan, indem Sie auf die Schaltfläche CT-Scan klicken.
Klicken Sie auf Ja, um das Bild zu erstellen. Klicken Sie auf Bild speichern, um das Bild im gewünschten Ordner zu speichern. Übertragen Sie die zuvor in 10 %igem Formalin gelagerten Proben des Schienbeins und des L4-Wirbels in eine 20 %ige Ameisensäurelösung für eine viertägige Entkalkung.
Waschen Sie nach der Entkalkung das Schienbein und den L4-Wirbel in einer Einbettbox mit fließendem Wasser für mehr als sechs Stunden. Dehydrieren Sie die Proben mit Alkohollösungen mit Gradientenkonzentration in einem automatisierten Gewebeprozessor. Legen Sie die Gewebeproben zwei Stunden lang in Xylol, um sie durchscheinend zu machen.
Anschließend legen Sie die permeabalisierten Proben drei Stunden lang in Paraffinwachs bei 60 Grad Celsius, bevor Sie sie in einen automatischen Prozessor einbetten. Gewinnen Sie 4 Mikrometer große Gewebeschnitte mit einem Rotationsschneider. Legen Sie die Abschnitte drei bis acht Minuten lang in Hämatoxylin-Färbung und ein bis drei Minuten in Eosin-Färbung.
Übertragen Sie die gefärbten Abschnitte nacheinander auf reinen Alkohol und Xylol. Versiegeln und fixieren Sie die Abschnitte mit neutralem Gummi, um sie unter einem optischen Mikroskop zu betrachten. Um eine hitzeinduzierte Epitopentnahme an den Tibiaschnitten durchzuführen, legen Sie das Trägerblatt in den entsprechenden Antigenreparaturpuffer in einem mikrowellengeeigneten Behälter.
Für die Antigenreparatur erhitzen Sie den Behälter 20 Minuten lang bei 98 Grad Celsius in der Mikrowelle. Spülen Sie nach dem Entfernen des Behälters das Innere 10 Minuten lang mit kaltem Leitungswasser aus. Um die endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren, inkubieren Sie die Tibiascheiben 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 3%igem Wasserstoffperoxid.
Waschen Sie die Abschnitte dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS. Dann werden die Proben mit normaler Ziegenserum-Blockierungslösung in einer feuchten Kammer 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Geben Sie je 200 Mikroliter RANKL-, Osteoprotegerin- oder OPG- und Sclerostin-Antikörper in die Schnittproben und inkubieren Sie die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius im Dunkeln.
Inkubieren Sie anschließend die Schnitte mit Biotin-markiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Nachdem Sie die mit PBS gespült haben, verwenden Sie Diaminobenzidin, um diese drei bis fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zu färben. Färben Sie die Abschnitte ein bis zwei Minuten lang mit Hämatoxylin, bevor Sie die dehydrierten und getrockneten Abschnitte mit neutralem Gummi versiegeln.
Geben Sie 25 Mikroliter kontrollierte, Standard- oder Probenproben in jede der jeweiligen Vertiefungen. Geben Sie dann 200 Mikroliter 17 Beta-Östradiol HRP-Konjugat in jede Vertiefung. Decken Sie alle Vertiefungen mit Folie ab und inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius.
Nachdem Sie die Flüssigkeit aus jeder Vertiefung entfernt haben, waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit 300 Mikrolitern 1X Waschlösung. Geben Sie dann 100 Mikroliter TMB-Substratlösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie. Geben Sie nach der Inkubation 100 Mikroliter Stopplösung in jede Vertiefung.
Schütteln Sie die Mikrotiterplatte vorsichtig 30 Sekunden lang, bevor Sie die Absorption der Probe bei 450 Nanometern innerhalb von 30 Minuten messen. Die rekonstruierten Mikro-CT-Bilder der rechten Tibia zeigten, dass die durch Ovariektomie induzierten trabekulären Strukturveränderungen, die in der Modell-OVX-Gruppe beobachtet wurden, bei ovariektomierten Ratten, die mit der Bazi Bushen-Kapsel oder der BZBS-Gruppe behandelt wurden, signifikant reduziert waren. Im Vergleich zur HAM-Gruppe zeigte der trabekuläre Knochen in der OVX-Gruppe eine signifikante Abnahme der Knochenmineraldichte.
Ein ähnlicher Trend zeigte sich bei der Knochenvolumenfraktion, der Anzahl der Knochentrabekel und der Knochentrabekeldicke. Ein gegenläufiger Trend zeigte sich beim trabekulären Trenngrad. Im Vergleich zu den OVX-Gruppen waren der Knochenvolumenanteil, die Anzahl der Knochentrabekel und die Knochentrabekeldicke in den Bazi Bushen-Behandlungsgruppen signifikant erhöht und der trabekuläre Trenngrad deutlich verringert.
Die Ergebnisse der Hämatoxylin- und Eosin-Färbung deuteten darauf hin, dass die histomorphologische Schädigung der Tibia in L4-Wirbeln ovariektomierter Ratten nach der Verabreichung von Bazi Bushen gelindert wurde. Die immunhistochemischen Ergebnisse zeigten, dass die Bazi Bushen-Behandlungsgruppen im Vergleich zu den OVX-Gruppen eine verminderte Expression von RANKL, eine erhöhte Expression von OPG und eine verminderte Expression von SOST zeigten. Verschiedene biochemische Marker des Knochenstoffwechsels bei ovariektomierten Ratten wurden durch die Behandlung mit Bazi Bushen ebenfalls verbessert.
Die Anwendung der Mikro-CT ist in hohem Maße für die Knochenforschung wiederverwendbar. Diese Technologie ist sehr praktisch für die Aufklärung der Knochenstruktur und kann gemäß Schritt drei bedient werden.
