该协议可以直观地实验结果，例如骨骼表型、代谢指标等。本实验的主要应用是显微CT，它可以进行组织3D重建的骨形态分析，它更大地基于他们的皮肤样本。要开始该程序，请在适当麻醉的大鼠身上局部注射布比卡因进行局部镇痛。
然后用无菌棉球用乙醇和聚维酮碘消毒剃须区域 3 次。使用手术刀在动物的腹部做一个 2 厘米的中线切口。使用镊子暴露完整的卵巢，并使用 4-0 手术缝合线在卵巢根部结扎。
在缝合中线切口之前，使用手术剪刀去除完整的卵巢。在胃内给药四个月并麻醉动物后，使用手术剪刀和镊子切开并剥开腹股沟皮肤，露出股动脉。使用真空采血管从股动脉采集血样。
然后用棉球按压以止血。继续切开并剥落下肢腹股沟的皮肤，露出完整的胫骨。取出胫骨并用生理盐水清洗 3 次。
使用镊子和眼科剪刀，从放置在盐水中的胫骨上去除多余的肌肉组织。使用无菌棉球用乙醇和聚维酮碘对腰椎 L4 的背部皮肤消毒 3 次。使用手术剪刀和镊子切开背部皮肤并露出腰椎 L4。用 ronguer 切断腰椎 L4 的上下椎骨，并用手术剪刀剪掉周围的骶骨。
使用镊子和微型剪刀从放置在盐水中放置的洗净的腰椎 L4 中去除多余的肌肉组织。将胫骨和 L4 椎骨在室温下储存在 10% 福尔马林组织液中三天。打开微型 CT 扫描仪后，启动软件加热 X 射线源。
通过单击 Create new sample 创建数据库，以生成一个文件，以便在获取下一个数据之前保存数据。在软件控制窗口中，分配数据采集参数。在 4 分钟内将 X 射线管电压设置为 50 千伏，将 CT X 射线管电流和实时 X 射线管电流设置为 100 微安，将视场设置为 18 毫米，无门控技术，并将扫描技术设置为高分辨率。
用生理盐水清洗胫骨 3 次后，用滤纸吸干多余的水。用塑料薄膜将胫骨组织包裹在床上以固定其位置。通过旋转仪器中的按钮，将胫骨组织调整到成像场的中心。
关闭仪器门并打开实时模式。按下捕获按钮以查看胫骨组织。单击 CT 扫描按钮开始扫描。
单击 yes 生成图像。点击 图片保存 将图片保存到所需的文件夹。将先前储存在 10% 福尔马林中的 tibia 和 L4 椎骨样本转移到 20% 甲酸溶液中进行为期 4 天的脱钙。
脱钙后，用流水清洗放置在包埋盒中的胫骨和 L4 椎骨 6 小时以上。在自动组织脱水机中用梯度浓度醇溶液对样品进行脱水。将组织标本置于二甲苯中 2 小时，使其呈半透明状。
然后将透化样品放入 60 摄氏度的石蜡中 3 小时，然后将它们包埋到自动处理器中。使用旋转切片机获得 4 微米的组织切片。将切片置于苏木精染色剂中 3 至 8 分钟，并将伊红染色剂中放置 1 至 3 分钟。
依次将染色切片转移到纯酒精和二甲苯中。用中性胶密封并固定切片，以便在光学显微镜下观察。为了在胫骨切片上进行热诱导表位修复，请将载体片放在可微波容器中适当的抗原修复缓冲液中。
对于抗原修复，将容器在 20 摄氏度下微波 98 分钟。取出容器后，用冷自来水冲洗其内部 10 分钟。为了阻断内源性过氧化物酶活性，将胫骨切片与 3% 过氧化氢在室温下孵育 15 分钟。
在 PBS 中洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。然后将样品与普通山羊血清封闭液在潮湿室中室温孵育 15 分钟。在切片样品中加入 200 μL RANKL、骨保护素或 OPG 和硬化蛋白抗体，并在 4 摄氏度下在黑暗中孵育样品过夜。
接下来，将切片与生物素标记的山羊抗兔 IgG 在室温下孵育 30 分钟。用 PBS 冲洗后，使用二氨基联苯胺在室温下对它们进行染色 3 到 5 分钟。用苏木精对切片进行染色一到两分钟，然后用中性胶密封脱水和干燥的部分。
向各自的孔中加入 25 μL 对照、标准品或样品。然后向每个孔中加入 200 微升 17 β-雌二醇 HRP 偶联物。用箔纸盖住所有孔，并将板在 37 摄氏度下孵育 2 小时。
从每个孔中取出液体后，用 300 μL 1X 洗涤液洗涤孔 3 次。然后向每个孔中加入 100 μL TMB 底物溶液并孵育。孵育后，向每个孔中加入 100 μL 终止液。
轻轻摇动微量滴定板 30 秒，然后在 30 分钟内测量样品在 450 纳米处的吸光度。重建的右侧胫骨显微 CT 图像显示，在 Bazi Bushen 胶囊或 BZBS 组治疗的卵巢切除大鼠中，模型 OVX 组观察到的卵巢切除术诱导的小梁结构变化显着减少。与 SHAM 组相比，OVX 组骨小梁骨密度显著降低。
骨体积分数、骨小梁数量和骨小梁厚度也出现了类似的趋势。小梁分离度呈相反趋势。与 OVX 组相比，八字布参治疗组骨体积分数、骨小梁数量和骨小梁厚度显著增加，骨小梁分离度显著降低。
苏木精和伊红染色结果显示，八字布申给药后，去卵巢大鼠 L4 椎骨胫骨组织形态学损伤得到缓解。免疫组化结果显示，与 OVX 组相比，八字布参处理组显示 RANKL 表达降低，OPG 表达增加，SOST 表达降低。Bazi Bushen 处理也改善了去卵巢大鼠骨代谢的各种生化标志物。
显微 CT 的应用在骨骼研究中具有高度的可重用性。这项技术对于启发骨骼结构非常方便，可以按照第三步进行作。
