Bu protokol, kemik fenotipi, metabolik göstergeler vb. gibi deneysel sonuçları sezgisel olarak deneyebilir. Bu deneyin ana uygulaması, kemik morfolojisi analizinin bir doku 3D rekonstrüksiyonunu gerçekleştirebilen mikro-BT'dir, cilt örneklerine dayanarak daha büyüktür. Prosedüre başlamak için, uygun şekilde anestezi uygulanmış bir sıçan üzerinde topikal bir bupivakain enjeksiyonu ile lokal analjezi uygulayın.
Daha sonra traş edilmiş alanı etanol ve povidon iyot ile üç kez dezenfekte etmek için steril bir pamuk topu kullanın. Bir neşter kullanarak, hayvanın karnında iki santimetrelik bir orta hat kesisi yapın. Forseps kullanarak sağlam yumurtalığı ortaya çıkarın ve 4-0 cerrahi sütür kullanarak yumurtalık kökünde ligate yapın.
Orta hat kesisini dikmeden önce cerrahi makas kullanarak sağlam yumurtalığı çıkarın. İlacın dört ay boyunca intragastrik olarak uygulanmasından ve hayvanın uyuşturulmasından sonra, cerrahi makas ve cımbız kullanarak femoral arteri ortaya çıkarmak için kasık derisini kesin ve soyun. Vakumlu kan alma tüpü kullanarak femoral arterden bir kan örneği alın.
Ardından kanamayı durdurmak için bir pamuk ile baskı uygulayın. Sağlam tibiayı ortaya çıkarmak için alt ekstremitedeki kasık derisini kesmeye ve soymaya devam edin. Tibiayı çıkarın ve üç kez tuzlu su ile yıkayın.
Cımbız ve oftalmik makas kullanarak, tuzlu suya yerleştirilen kaval kemiğindeki fazla kas dokusunu çıkarın. Steril bir pamuk top kullanarak lomber L4'ün arka derisini etanol ve povidon iyot ile üç kez dezenfekte edin. Sırt derisini kesmek ve bel L4'ü ortaya çıkarmak için cerrahi makas ve cımbız kullanın. Bel L4'ün üst ve alt omurlarını bir ronguer ile kesin ve etrafındaki sakrumu cerrahi makasla kesin.
Cımbız ve mikro makas kullanarak tuzlu su içine yerleştirilmiş yıkanmış bel L4'teki fazla kas dokusunu çıkarın. Tibia ve L4 omurunu üç gün boyunca oda sıcaklığında% 10 formalin doku sıvısı içinde saklayın. Mikro CT tarayıcıyı açtıktan sonra, X-ışını kaynağını ısıtmak için yazılımı başlatın.
Bir sonrakini almadan önce verileri kaydetmek üzere bir dosya oluşturmak için yeni örnek oluştur'a tıklayarak bir veritabanı oluşturun. Yazılım kontrol penceresinde, veri toplama parametrelerini atayın. X-ışını tüpü voltajını 50 kilovolta, CT X-ışını tüpü akımını ve canlı X-ışını tüpü akımını 100 mikro ampere, görüş alanını 18 milimetreye, geçit tekniğine ve tarama tekniğini dört dakika içinde yüksek çözünürlüğe ayarlayın.
Kaval kemiğini tuzlu su ile üç kez yıkadıktan sonra, fazla suyu filtre kağıdı ile kurulayın. Konumunu sabitlemek için tibia dokusunu yatağın üzerine plastik bir film ile sarın. Cihazdaki düğmeyi çevirerek tibia dokusunu görüntüleme alanının merkezine ayarlayın.
Alet kapağını kapatın ve canlı modu açın. Tibial dokuyu görüntülemek için yakalama düğmesine basın. CT tarama düğmesine tıklayarak taramayı başlatın.
Görüntüyü oluşturmak için evet'i tıklayın. Görüntüyü istediğiniz klasöre kaydetmek için görüntü kaydetmeye tıklayın. Daha önce% 10 formalin içinde saklanan tibia ve L4 vertebra örneklerini dört günlük bir dekalsifikasyon için% 20 formik asit çözeltisine aktarın.
Dekalsifikasyondan sonra, bir gömme kutusuna yerleştirilen tibia ve L4 omurunu altı saatten fazla akan su ile yıkayın. Numuneleri otomatik bir doku işlemcisinde gradyan konsantrasyonlu alkol çözeltileri ile kurutun. Doku örneklerini yarı saydam hale getirmek için iki saat boyunca ksilene yerleştirin.
Ardından, geçirgenleştirilmiş numuneleri otomatik bir işlemciye gömmeden önce üç saat boyunca 60 santigrat derecede parafin mumuna yerleştirin. Döner dilimleyici kullanarak 4 mikronluk doku kesitleri elde edin. Bölümleri üç ila sekiz dakika hematoksilen boyasına ve bir ila üç dakika boyunca eozin boyasına yerleştirin.
Lekeli bölümleri sırayla saf alkol ve ksilene aktarın. Optik mikroskop altında görüntülemek için bölümleri nötr sakızla kapatın ve sabitleyin. Tibia bölümlerinde ısıya bağlı epitop alımı yapmak için, taşıyıcı tabakayı mikrodalgaya uygun bir kapta uygun antijen onarım tamponuna yerleştirin.
Antijen onarımı için, kabı 98 santigrat derecede 20 dakika mikrodalgada pişirin. Kabı çıkardıktan sonra, içini 10 dakika soğuk musluk suyuyla durulayın. Endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek için, tibia dilimlerini oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 3 hidrojen peroksit ile inkübe edin.
PBS'deki bölümleri her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Daha sonra numuneleri normal keçi serumu bloke etme solüsyonu ile nemli bir odada oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Dilim örneklerine her biri 200 mikrolitre RANKL, osteoprotegerin veya OPG ve sklerostin antikorları ekleyin ve örnekleri gece boyunca karanlıkta dört santigrat derecede inkübe edin.
Daha sonra, bölümleri biotin etiketli keçi tavşan önleyici IgG ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. PBS ile duruladıktan sonra, bunları oda sıcaklığında üç ila beş dakika lekelemek için diaminobenzidin kullanın. Susuz kalmış ve kurutulmuş bölümleri nötr sakızla kapatmadan önce bölümleri bir ila iki dakika hematoksilen ile boyayın.
İlgili kuyucukların her birine 25 mikrolitre kontrollü, standart veya numune ekleyin. Daha sonra her bir oyuğa 200 mikrolitre 17 beta-estradiol HRP konjugatı ekleyin. Tüm kuyucukları folyo ile örtün ve plakayı iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Sıvıyı her kuyucuktan çıkardıktan sonra, kuyuları 300 mikrolitre 1X yıkama solüsyonu ile üç kez yıkayın. Daha sonra her bir oyuğa 100 mikrolitre TMB substrat çözeltisi ekleyin ve inkübe edin. Kuluçka sonrası, her oyuğa 100 mikrolitre durdurma çözeltisi ekleyin.
Numunenin emilimini 30 dakika içinde 450 nanometrede ölçmeden önce mikro titre plakasını 30 saniye boyunca hafifçe sallayın. Sağ tibianın yeniden yapılandırılmış mikro BT görüntüleri, model OVX grubunda görülen ovariektominin neden olduğu trabeküler yapısal değişikliklerin, Bazi Bushen kapsülü veya BZBS grubu ile tedavi edilen yumurtalıklı sıçanlarda önemli ölçüde azaldığını ortaya koydu. SHAM grubu ile karşılaştırıldığında, OVX grubundaki trabeküler kemik, kemik mineral yoğunluğunda önemli bir azalma gösterdi.
Benzer bir eğilim kemik hacmi fraksiyonu, kemik trabeküllerinin sayısı ve kemik trabeküler kalınlığı için de görülmüştür. Trabeküler ayrılma derecesi için zıt bir eğilim görüldü. OVX grupları ile karşılaştırıldığında, Bazi Bushen tedavi gruplarında kemik hacmi fraksiyonu, kemik trabekülü sayısı ve kemik trabeküler kalınlığı önemli ölçüde artmış ve trabeküler ayrılma derecesi belirgin şekilde azalmıştır.
Hematoksilen ve eozin boyama sonuçları, yumurtalıklı sıçanların L4 vertebralarındaki tibiadaki histomorfolojik hasarın Bazi Bushen uygulandıktan sonra hafiflediğini gösterdi. İmmünohistokimya sonuçları, OVX gruplarıyla karşılaştırıldığında, Bazi Bushen tedavi gruplarının RANKL ekspresyonunda azalma, OPG ekspresyonunda artış ve SOST ekspresyonunda azalma gösterdiğini gösterdi. Yumurtalıklı sıçanlarda kemik metabolizmasının çeşitli biyokimyasal belirteçleri de Bazi Bushen tedavisi ile iyileştirildi.
Mikro BT uygulaması, kemik araştırmaları için yüksek oranda tekrar kullanılabilir. Bu teknoloji kemik yapısını aydınlatmak için çok uygundur ve üçüncü adıma göre çalıştırılabilir.
