פרוטוקול זה יכול באופן אינטואיטיבי תוצאות ניסיוניות כגון פנוטיפ עצם, אינדיקטורים מטבוליים, וכן הלאה. היישום העיקרי של ניסוי זה הוא micro-CT, אשר יכול לבצע שחזור 3D רקמות של ניתוח מורפולוגיה עצם, זה גדול יותר על בסיס שלהם דגימות עור. כדי להתחיל את ההליך, להחיל שיכוך כאבים מקומי עם הזרקה מקומית של bupivacaine על חולדה מורדמת כראוי.
לאחר מכן השתמש בכדור צמר גפן סטרילי כדי לחטא את האזור המגולח עם אתנול ויוד פובידון שלוש פעמים. באמצעות אזמל, לבצע חתך קו אמצע שני סנטימטרים על הבטן של החיה. חשוף את השחלה השלמה באמצעות מלקחיים וקשר בשורש השחלה באמצעות תפר כירורגי 4-0.
יש להסיר את השחלה השלמה באמצעות מספריים כירורגיים לפני תפירת החתך בקו האמצע. לאחר מתן תוך קיבה של התרופה במשך ארבעה חודשים והרדמה של החיה, לחתוך ולקלף את העור של המפשעה כדי לחשוף את עורק הירך באמצעות מספריים כירורגיים פינצטה. איסוף דגימת דם מעורק הירך באמצעות צינור איסוף דם ואקום.
לאחר מכן להפעיל לחץ עם כדור צמר גפן כדי לעצור דימום. המשך לחתוך ולקלף את העור של המפשעה בגפה התחתונה כדי לחשוף את השוקה שלמה. מוציאים את השוקה ושוטפים אותה שלוש פעמים במי מלח.
באמצעות פינצטה ומספריים אופתלמיים, להסיר רקמת שריר עודפת מן השוקה ממוקם מלוחים. לחטא את העור האחורי של L4 המותני שלוש פעמים עם אתנול ויוד פובידון באמצעות כדור צמר גפן סטרילי. השתמש מספריים כירורגיים פינצטה לחתוך את העור האחורי ולחשוף את L4 המותני. חותכים את החוליות העליונות והתחתונות של L4 המותני עם רונגר וחותכים את העצה סביבו במספריים כירורגיים.
הסר רקמת שריר עודפת מן המותני שטוף L4 ממוקם מלוחים באמצעות פינצטה מספריים מיקרו. אחסנו את חוליית השוקה וה-L4 בנוזל רקמת פורמלין 10% בטמפרטורת החדר למשך שלושה ימים. לאחר הפעלת סורק המיקרו CT, הפעל את התוכנה כדי לחמם את מקור הרנטגן.
צור מסד נתונים על-ידי לחיצה על צור דוגמה חדשה כדי ליצור קובץ לשמירת הנתונים לפני השגת הקובץ הבא. בחלון בקרת התוכנה, הקצה את פרמטרי רכישת הנתונים. הגדר את מתח צינור הרנטגן ל -50 קילו וולט, זרם צינור רנטגן CT וזרם שפופרת רנטגן חי ל -100 מיקרו אמפר, שדה הראייה ל -18 מילימטרים, ללא טכניקת גאט, וטכניקת הסריקה לרזולוציה גבוהה תוך ארבע דקות.
לאחר שטיפת השוקה במי מלח שלוש פעמים, מחקו את עודפי המים בנייר פילטר. עטפו את רקמת השוקה על המיטה בסרט פלסטיק כדי לתקן את מיקומה. כוונן את רקמת השוקה למרכז שדה ההדמיה על ידי סיבוב הכפתור במכשיר.
סגור את דלת המכשיר והפעל את מצב החי. לחץ על לחצן הלכידה כדי להציג את הרקמה הטיביאלית. התחל את הסריקה על ידי לחיצה על לחצן סריקת CT.
לחץ על כן כדי להפיק את התמונה. לחץ על שמירת התמונה כדי לשמור את התמונה בתיקייה הרצויה. העבירו את דגימות חוליות השוקה וה-L4 שאוחסנו בעבר ב-10% פורמלין לתמיסת חומצה פורמית 20% להסתיידות בת ארבעה ימים.
לאחר ההסתיידות, יש לשטוף את השוקה ואת חוליית L4 שהונחו בקופסת הטבעה עם מים זורמים למשך למעלה משש שעות. יש לייבש את הדגימות עם תמיסות אלכוהול בריכוז הדרגתי במעבד רקמות אוטומטי. הניחו את דגימות הרקמה בקסילן למשך שעתיים כדי להפוך אותן לשקופות.
לאחר מכן הניחו את הדגימות החדירות בשעוות פרפין בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות לפני הטמעתן במעבד אוטומטי. קבל 4 מקטעי רקמה מיקרון באמצעות כלי פריסה סיבובי. מניחים את החלקים בכתם המטוקסילין למשך שלוש עד שמונה דקות וכתם אאוזין למשך דקה עד שלוש דקות.
מעבירים את החלקים המוכתמים ברצף לאלכוהול טהור וקסילן. אטמו וקיבעו את החלקים עם מסטיק נייטרלי לצפייה תחת מיקרוסקופ אופטי. כדי לבצע שליפת אפיטופ הנגרמת מחום על חלקי השוקה, הניחו את יריעת הנשא במאגר תיקון האנטיגן המתאים במיכל הניתן למיקרוגל.
לתיקון אנטיגן, יש לחמם את המיכל במיקרוגל למשך 20 דקות בחום של 98 מעלות צלזיוס. לאחר הסרת המיכל, שטפו את חלקו הפנימי במי ברז קרים במשך 10 דקות. כדי לחסום פעילות פרוקסידאז אנדוגני, דגרו על פרוסות השוקה עם 3% מי חמצן במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
שטפו את החלקים ב-PBS שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד. לאחר מכן לדגור את הדגימות עם פתרון חסימת סרום עיזים רגיל בתא לח במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הוסיפו 200 מיקרוליטר כל אחד של נוגדנים RANKL, osteoprotegerin, או OPG, וסקלרוסטין לתוך דגימות הפרוסה, ודגרו על הדגימות במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס בחושך.
לאחר מכן, דגרו על החלקים עם IgG נגד ארנב עיזים עם תווית ביוטין בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר שטיפת PBS, השתמשו בדיאמינובנזידין כדי להכתים אותם למשך שלוש עד חמש דקות בטמפרטורת החדר. צובעים את החלקים בהמטוקסילין למשך דקה עד שתי דקות לפני שאיטום החלקים המיובשים והמיובשים עם מסטיק ניטרלי.
הוסף 25 מיקרוליטר של מבוקר, סטנדרטי או מדגם לכל אחת מהבארות שלהם. לאחר מכן יש להוסיף 200 מיקרוליטר של 17 בטא-אסטרדיול HRP מצומד לכל באר. מכסים את כל הבארות בנייר כסף ודגרים על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
לאחר הסרת הנוזל מכל באר, לשטוף את הבארות שלוש פעמים עם 300 מיקרוליטר של 1X פתרון כביסה. לאחר מכן להוסיף 100 מיקרוליטר של פתרון מצע TMB לכל באר לדגור. לאחר הדגירה, להוסיף 100 מיקרוליטר של תמיסת עצירה לכל באר.
נערו בעדינות את צלחת המיקרו טיטר למשך 30 שניות לפני מדידת ספיגת הדגימה ב-450 ננומטר תוך 30 דקות. צילומי מיקרו CT משוחזרים של עצם השוקה הימנית גילו כי השינויים המבניים הטרבקולריים הנגרמים על ידי כריתת שחלות שנצפו בקבוצת מודל OVX הופחתו באופן משמעותי בחולדות שעברו כריתת שחלות שטופלו בקפסולת באזי בושן או בקבוצת BZBS. בהשוואה לקבוצת SHAM, העצם הטרבקולרית בקבוצת OVX הראתה ירידה משמעותית בצפיפות המינרלים בעצם.
מגמה דומה נצפתה עבור חלק נפח העצם, מספר trabeculae עצם ועובי trabecular עצם. מגמה הפוכה נצפתה בתואר ההפרדה הטרבקולרית. בהשוואה לקבוצות OVX, מקטע נפח העצם, מספר טרבקולי העצם ועובי טרבקולרי העצם בקבוצות הטיפול בבאזי בושן גדלו באופן משמעותי ודרגת ההפרדה הטרבקולרית פחתה במידה ניכרת.
תוצאות צביעת המטוקסילין ואוזין הצביעו על כך שהנזק ההיסטומורפולוגי בשוקה בחוליות L4 של חולדות שעברו כריתת שחלות הוקל לאחר מתן באזי בושן. תוצאות האימונוהיסטוכימיה הראו כי בהשוואה לקבוצות OVX, קבוצות הטיפול בבאזי בושן הראו ביטוי מופחת של RANKL, ביטוי מוגבר של OPG וביטוי מופחת של SOST. סמנים ביוכימיים שונים של מטבוליזם עצם בחולדות שעברו כריתת שחלות שופרו גם הם על ידי טיפול באזי בושן.
היישום של מיקרו CT הוא רב פעמי מאוד לחקר העצם. טכנולוגיה זו נוחה מאוד להארה של מבנה העצם וניתן לנתח אותה לפי השלב השלישי.
