小鼠胰腺内皮细胞的分离

本研究的目的是加深我们对胰腺脉管系统在正常胰腺生物学和疾病发展中的作用的理解。通过成功富集内皮部分，我们试图确定脉管系统中控制胰腺功能的特定途径，这些途径有可能在疾病环境中恢复和增强胰腺功能。最近，人们越来越重视内皮细胞功能障碍在胰腺病理中的作用。

对胰腺内皮细胞群异质性的鉴定使人们能够了解胰腺内皮相互作用如何促进或预防疾病。单细胞或单核 RNA 测序、蛋白质组学和基因组学等组学方法正被用于在细胞水平上研究胰腺。为了获得组织或空间层面的见解，正在使用无偏倚和基于探针的方法（如 Visium 和 Xenium）的新平台正在实施。

在该方案中，我们描述了一种温和的解离技术，该技术可最大限度地减少内源性胰酶降低细胞活力，以及一种选择性富集内皮细胞的磁性细胞分选程序。我们方案的解离和富集策略将能够进一步了解细胞表面标志物和胰腺内皮细胞的转录组，这些细胞以前由于技术限制而被探索不足。首先，将安乐死的鼠标放在手术台上。

拉伸鼠标四肢并用别针固定它们。使用手术剪刀，从下腹部区域穿过皮肤和腹膜做一个小的中线切口，然后向胸部区域延伸。切开横膈膜并提起肋骨以露出心脏。

将一根 25 至 30 号针头插入装有冰冷无菌 PBS 的注射器，插入心脏左心室。以每分钟 5 至 10 毫升的速度灌注心脏，注射 10 毫升后停止。然后，使用解剖剪刀和镊子小心地提取胰腺。

将胰腺转移到含有 10 毫升冰冷 PBS 和胰蛋白酶抑制剂的 50 毫升试管中，然后将试管放在冰上。首先，在含有冰冷 PBS 的培养皿中获得小鼠胰腺。使用手术剪刀和镊子小心去除多余的组织。

将修剪过的胰腺转移到含有 1 毫升解离溶液的 5 毫升试管中。用解剖剪刀将胰腺组织切成细块，将试管保持在冰上。将裂解物转移到置于冰上的 50 ml 试管中。

向 5 毫升试管中加入 2 毫升胶原酶溶液，以去除任何残留的胰腺组织并将其转移到 50 毫升试管中。将试管置于 37 摄氏度回火的水浴中孵育 20 分钟。将装有组织匀浆的试管放在冰上，让它在重力作用下沉降。

然后将上清液通过 70 微米过滤器，加入 5 毫升解离终止液。使用 27 号针头，用另外 1 毫升解离溶液研磨剩余的沉淀，然后像以前一样通过过滤器。将细胞悬液在 4 °C 下以 300 G 离心 10 分钟，然后将沉淀重悬于 1 mL 洗涤缓冲液中。

在旋转器上用 1 μL 抗 CD31 生物素抗体孵育 1 次 10 次至 7 个细胞的幂。加入 20 μL 抗生物素 MicroBeads，再孵育 40 分钟。然后设置带有色谱柱分离器支架的磁力架并应用色谱柱。

平衡色谱柱后，向其中加入样品，并用总共 9 mL 的洗涤缓冲液洗涤。从支架中取出色谱柱，并将其放入 15 mL 试管中。向色谱柱中加入 5 mL 洗涤缓冲液。

使用柱塞，将柱中的细胞向下推，以收集含有内皮细胞的洗脱液。最后，降低流出液和洗脱馏分。重悬后，对细胞进行计数并测量活力。

验证内皮细胞富集的定量 PCR 分析表明，与流通样品相比，富集组分的标记基因 Pecam1 和 Kdr 水平显著升高。在富集的组分中观察到较低水平的 NK6 同源框 1，胰腺内分泌细胞中的转录因子。蛋白质印迹显示 CD31 在预期大小的强烈信号，进一步证实了组分中内皮细胞的富集。